1、第四章 植物病害檢疫檢驗技術(shù),第一節(jié) 植物檢疫性真菌常見檢疫檢驗技術(shù),直接檢驗比重檢驗染色檢驗洗滌檢驗保濕萌芽檢驗分離培養(yǎng)檢驗,1、適用范圍 混雜在種子間的較大病原體（線蟲癭、菌核） 污染大量病菌孢子的種子（小麥腥黑穗病） 種子帶明顯病癥的病粒（小麥黑胚?。?（一）直接檢驗-----肉眼檢驗,小麥黑胚病粒,腥黑穗病,在檢查時應(yīng)先進行外表和周圍的檢查，然后，由表及里仔細觀察病害癥狀、菌癭、菌核等病癥。

2、 對于苗木、接穗、插條等，應(yīng)注意莖、葉、芽、根各部位，并需檢查粘著和夾帶的土壤。 對塊莖、塊根以及鱗莖，應(yīng)特別注意芽眼、凹陷處、傷口和附著的土壤。,主要工具：放大鏡或解剖鏡。,檢查要求：,,2、檢驗方法： 將送驗樣品分出一半試樣，放在白紙或白色塘瓷盤中，檢出線蟲癭、麥角菌、黑粉菌球、菌核及病粒，稱其重量，計算病害感染率。,3、注意 無病征的種子不一定是無病的種子。 不同的病害可以表現(xiàn)類似的癥狀， 同一病害

3、也可產(chǎn)生不同的癥狀。 在確定某種病害時，須與其他方法配合使用。,1、適用范圍 檢查混雜在種子內(nèi)較大的病原體如菟絲子、菌核、線蟲癭和雜草種子等。 利用病原體與種子形狀、大小的不同，通過一定的篩孔將病原體篩出來，然后進行分類稱重。,（二）過篩檢驗,大豆菟絲子為害,2、檢驗方法 將送驗樣品分出一半作為試樣，用規(guī)定孔徑的篩子過篩。 各層樣品倒入白瓷盤內(nèi)檢查，最下層的雜質(zhì)倒入黑玻璃盤中用肉眼或放大鏡檢查。,病原體含量(%)=,,

4、病原體重量(g),試樣重量(g),×100,,過篩檢驗主要用于檢驗糧谷、種子、油料、干果和生藥材。,1、適用范圍：種子表面帶病而肉眼看不見的種子病害。（附著在種子表面的病菌孢子）,（三）洗滌檢驗,小麥矮腥黑穗病菌,,洗滌檢驗法原理：主要用于檢查附著在種子表面的各種真菌孢子。種子表面常附著真菌孢子，將一定量的樣品放入容器內(nèi)，加一定量的無菌水，充分振蕩，可使病菌孢子洗滌下來，而后離心后，可沉淀，鏡檢沉淀物可確定其種類和數(shù)量。

5、主要儀器和試劑：振蕩器、離心機、顯微鏡、0.1％吐溫溶液等,2、檢驗方法： 樣品制備：取樣(5g)2份于100ml三角瓶內(nèi)，加蒸餾水10ml（加0.1％吐溫溶液），振蕩5～10min， 顯微計數(shù)：懸浮液2000～3000r/min離心5～15min，吸去上清液，留1ml沉淀部分，滴于5個載玻片，加蓋玻片鏡檢，每片檢查10個視野，并計算每視野平均孢子數(shù),N=n1×n2×n3/m式中： N－－每克種子的孢子負荷量

6、 n1－－每視野平均孢子數(shù) n2－－蓋玻片面積上的視野數(shù) n3－－1ml水的滴數(shù) m－－供試樣品的重量（g）,如果鏡檢洗滌液時，沒有檢查到病菌孢子，則對同一樣品要重復(fù)幾次取樣洗滌，對每一洗滌液至少要鏡檢5張玻片。當一個樣品兩次取樣，洗滌檢驗的結(jié)果相差很大時，則需要重復(fù)一次。,檢驗結(jié)果有四個影響因素： a．種子或其他糧谷類產(chǎn)品表面所粘附的病菌孢子，不一定能完全洗滌下來。,b．在離心管內(nèi)，懸浮液表面常形成一層極難沉降的孢子薄膜，而

7、管壁上也可能粘附著孢子，使檢驗結(jié)果很難代表實際情況，因而影響計算的準確性；,c．將懸浮液滴于玻片時，由于孢子迅速沉淀，造成一些視野間孢子分布極不均勻，這也影響計數(shù)的準確性，都可能增加誤差程度；,d．操作不夠嚴格，會造成人為誤差，以及制樣中也會出現(xiàn)偏差。,,原理：由于菌癭、菌核、病秕粒，都要比健康籽粒輕。若將其浸入一定濃度的食鹽水（糖、泥土等）或其他溶液中時，就會浮于液面。撈取浮物，結(jié)合解剖鏡進行檢驗，即可鑒定其種類。,（四）比重檢驗法,

8、比重檢驗法一般用于檢驗種子、糧谷、豆類中的菌癭、菌核和病秕籽粒等。,原理：某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原物本身，?？捎锰厥獾幕瘜W(xué)藥品處理，使其染上特有的顏色，幫助檢出和區(qū)分病蟲種類。這種方法即為染色檢驗法。例如：馬鈴薯癌腫?。ㄊ韷K上癌瘤不明顯時，可做徒手切片，加1滴1％的“藏花紅”染色液，健康組織細胞壁呈亮紅色，感病組織細胞壁呈暗紅色。麥類赤霉病的檢驗：將病粒放在0.5-1%對硝基苯胺酒精溶液中，經(jīng)2-3小時，受侵染

9、部分或有菌絲分布的部分呈現(xiàn)暗紅色至咖啡色，而未受侵染部分為黃色，50℃溫度下顏色更明顯。,（五）染色檢驗法,（六）解剖檢查法,有許多病害或一些病害初發(fā)生階段，在種子、苗木及其他植物產(chǎn)品表面沒有明顯的癥狀，診斷比較困難有時為要了解病原物潛伏的場所，常常需要用解剖檢驗進行鑒定，如散黑穗病菌以菌絲體在胚中越冬,有的果樹病害以菌絲體在花芽或鱗片中越冬。,解剖檢驗主要采用徒手切片或切片機切片，經(jīng)過染色，制成玻片標本后，放在顯微鏡下觀察鑒定。對

10、于某些病害或種子苗木及其產(chǎn)品，有時采用粗放的解剖方法也可進行檢查。,（七）保濕萌芽檢驗原理：種子攜帶的真菌，無論外表黏附的還是潛伏種子內(nèi)的，在種子萌發(fā)階段即可開始侵染，甚至有些在種子還未萌發(fā)時就可長出病菌。主要儀器及試劑：吸水紙、沙土、冰箱、培養(yǎng)箱等。,常規(guī)植物病理學(xué)方法,保濕萌芽檢驗的方法： 1、保濕培養(yǎng)檢驗 2、沙內(nèi)萌芽檢驗 3、土內(nèi)萌芽檢驗 4、試管幼

11、苗癥狀測定,1．保濕培養(yǎng)檢驗 此法一般又分為：吸水紙法、冰凍吸水法和瓊脂平皿法等。,(1) 吸水紙法 廣泛用于各種類型的種子，包括禾谷類、豆類、麻類、煙草、各種蔬菜、觀賞植物和樹木種子等種傳真菌病害的檢驗。,吸水紙法的標準操作： a 用三層無菌吸水紙，吸足無菌水后，滴掉多余的水，放人經(jīng)消毒的培養(yǎng)皿內(nèi)，將種子排列在吸水紙上。 b 各粒種子間要保持一定距離，一般不得少于1-1.5cm，再將培養(yǎng)皿置于適當溫濕度的

12、恒溫箱培養(yǎng)。 c 在培養(yǎng)期間，每天用12h光照和黑暗交替處理，保持一定周期。 d 作物種子和病菌一般經(jīng)2-10d培養(yǎng)，種子表面就會長出待檢病菌，最后進行鏡檢。,優(yōu)點:設(shè)備簡單，應(yīng)用范圍廣，操作方便；花費少，快速準確，易于掌握；受檢病癥立體感強，容易鑒定和便于制作標本等。缺點:在此條件下，有些真菌的菌絲生長不旺盛和產(chǎn)孢量少，而很快被許多雜菌快速生長，超過或掩蓋被檢病菌。,吸水紙法的特點：,(2)冰凍吸水法 這是一種

13、改進的保濕培養(yǎng)法，其操作步驟如下： a 種子排列在吸水紙上，一般谷物種子在10℃下保持3d，使其先萌芽。 b 20℃的溫度下，保持2d（其他種子在20℃下保持4d)。 c 再將幼苗在-20℃的溫度下，進行冰凍過夜，以死亡的幼苗作為培養(yǎng)基。 d 20℃的溫度下，用光／暗交替處理12h，保持5-7d。 為了防止細菌的污染，可在吸水紙上加些抗生素，如2×10-4金霉素或土霉素等數(shù)滴。,優(yōu)點：有利于病

14、原物形成孢子，同時又避免因種子萌芽伸長后造成相互覆蓋，便于檢查。,(3)瓊脂平皿法 此法與吸水紙法所不同之處，就是用1.5%-1.7％瓊脂，經(jīng)滅菌后倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成一定厚度的平面，代替吸水紙。 優(yōu)點：因含水量均勻一致，有利于病原菌生長，皿內(nèi)潔凈，雜菌少，便于檢查，因此常用于植物檢疫檢驗。,瓊脂平皿法用于棉花枯、黃萎病菌的檢驗。,將沙用清水洗去泥垢，然后用沸水煮過，鋪在經(jīng)酒精或福爾馬林液消毒過的萌芽器內(nèi)，加

15、冷開水至含沙量的60％左右。 沙面應(yīng)低于容器邊緣4cm，在鋪平的沙上排列種子，間隔一定距離。排好種子后，再加細沙覆蓋2-3cm，并加容器蓋，置于25℃的溫箱中。 當?shù)谝粋€幼芽長高碰到頂蓋時，即應(yīng)去蓋。經(jīng)過一定時期，將幼芽連根取出，并取出發(fā)芽的種子，根據(jù)幼苗和未發(fā)芽種子所表現(xiàn)的癥狀及種苗上有無孢子，就可計算發(fā)芽率及發(fā)病率。,2．沙內(nèi)萌芽檢驗,3．土內(nèi)萌芽檢驗 將種子播種在含有滅菌土壤的盆缽或播種箱內(nèi)，保持適

16、宜發(fā)芽的溫、濕度。待種子發(fā)芽出土后，進行檢驗，分析其發(fā)病情形。,4．試管幼苗癥狀測定 做試管斜面，每管放人1粒種子，塞緊管口。再置于20℃下，用人工光照和黑暗各半處理。當幼苗達到管頂時，即可將管蓋取掉。待培養(yǎng)期到后，檢查幼苗癥狀。,保濕萌芽檢驗的優(yōu)點: 容易檢查根部和綠色部分，也可避免相互傳染，但操作較麻煩，一般可用于檢驗珍貴的繁殖材料。,保濕萌芽檢驗的缺點： 1、在對寄主生長發(fā)育不良，而適宜于病菌生長發(fā)育的條

17、件下，則某些腐生菌可能變成萌芽階段的寄生菌，造成幼芽發(fā)生部分病斑。,2、由于主要還是依靠肉眼檢查，多種病害可以產(chǎn)生類似的病癥，就是同一種病害也可發(fā)生不同的癥狀等，這些情況都足以影響檢驗結(jié)果的準確性。,（八）分離培養(yǎng)檢驗,分離培養(yǎng)主要應(yīng)用于檢驗潛伏于種子、苗木或其他植物新產(chǎn)品內(nèi)部，不易發(fā)現(xiàn)和鑒定的病原菌；或當種子、苗木或其他植物產(chǎn)品上雖有病斑，但無特殊性的病原菌可供鑒定的場合。不同的病原菌，其所用的培養(yǎng)基、分離方法、培養(yǎng)條件等不盡相同

18、，必須因病制宜地加以使用。 通過分離培養(yǎng)所得到的待檢病菌，應(yīng)通過必要的步驟進行仔細鑒定。,分離真菌的方法有： 1、組織分離法： 將樣品材料經(jīng)表面消毒并沖洗后切成小塊，輕輕置于培養(yǎng)基平板表面，寫好標簽后，即可培養(yǎng)觀察。,2、稀釋分離法：將寄主組織受害部位的孢子洗下配成懸浮液，經(jīng)稀釋后與熔化并冷卻45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，然后倒在滅菌的培養(yǎng)基中。,,從種子、苗木及其他繁殖材料上獲得的病菌，有時還需接種到植株上，使其表現(xiàn)典型癥狀后，再

19、檢查鑒別。,（九）接種方法,,由于病原種類與傳播方式不同，其接種的方法也各不相同，常用接種方法有下列幾種： (1)拌種接種：用病菌孢子拌種，是接種黑粉?。ㄈ绨群谒氩。┳畛Ｓ玫姆椒ā?(2）浸種接種：用病原真菌孢子懸浮液浸種，也是常用的接種方法。 (3)花期接種法：主要用于從花期侵入的病菌。如：大麥、小麥散黑穗病菌的接種。在抽穗后1-2天，用冬孢子懸浮液注射到花內(nèi)。 (4）整株噴霧接種：孢子懸浮液噴在葉片或莖部 (

20、5)土壤接種法：針對一些土傳病菌，如棉花枯、黃萎菌。,核酸技術(shù)是一種DNA分析鑒定技術(shù)，其方法快速、準確，因此，在植物病原菌的分類鑒定和親緣關(guān)系分析等方面已有廣泛的應(yīng)用 。 核酸技術(shù)基于PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)），它是一種體外DNA擴增技術(shù)，由于其快速、準確、所需樣品量少的特點，十分符合植物檢疫檢驗過程的要求。根據(jù)不同的檢疫對象，需設(shè)計出特異性的引物，就可鑒定特定的病原菌。,（十） 核酸技術(shù),(十) 隔離種植檢驗

21、 不易發(fā)現(xiàn)癥狀或病原物，需要在生長發(fā)育階段進行病害觀察或分析鑒定。 隔離種植應(yīng)在溫室或極為嚴密的隔離區(qū)進行，并在各個生長發(fā)育階段進行觀察。,對不同的病害，用不同的方法：,1.2.3.4.5.,對較大的病原體,過篩,肉眼,對種子外表有明顯癥狀的,表面帶菌但看不見的,洗滌,濾紙培養(yǎng),胚內(nèi)病菌,離體胚培養(yǎng),種子內(nèi)部的病原菌,瓊脂培養(yǎng),肉眼,,,第二節(jié) 植物病原細菌檢疫檢驗技術(shù),主講：王曉東 副教授,所有已知植物細菌病害都可以

22、通過種苗傳播，通過種子傳病的占40％以上，準確檢測種子和種苗是否攜帶檢疫性病原細菌，是防治這類病害的關(guān)鍵。,一、病原細菌的檢測,植物病原細菌的檢測方法，大致可分為直接檢測和間接檢測兩大類。直接檢測：檢測病原細菌時，病原物不被提取或分離出來。間接檢測：先把病原細菌提取、分離或破壞以后進行檢測。 又分為活菌檢測和非活菌檢測。,（一）直接檢測,1.直觀檢驗 直觀檢驗是以癥狀為主的田間檢測，植物細菌病害的產(chǎn)地檢疫主要是以這種方式

23、進行的。通過肉眼觀察植株的癥狀、菌膿以及鏡檢觀察，并結(jié)合田間診斷結(jié)果而做出。,,,,快速診斷細菌性病害方法----細菌溢,,2. 生長檢驗 ：生長檢驗有實驗室和田間幼苗癥狀檢驗兩種。(1)實驗室檢驗：這種檢驗是將種子播種在濕潤吸水紙上，或水瓊脂培養(yǎng)基平板上，根據(jù)幼芽和幼苗癥狀做出初步診斷。 (2)田間幼苗癥狀檢驗：此法常受到環(huán)境條件的影響。 在植物檢疫中，生長檢驗多作為初步檢驗。,（二）間接檢測,1. 活菌檢測（1）分

24、離培養(yǎng)法檢驗A 分離病原細菌 一般用稀釋分離法。稀釋分離有以下兩種方法。 培養(yǎng)皿稀釋分離法 平板劃線分離法,培養(yǎng)皿稀釋分離法,,平板劃線分離法,取小塊病組織用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間，用滅菌的移植環(huán)蘸取以上組織液在瓊膠平板上劃線培養(yǎng)；先在平板的一側(cè)順序劃3～5條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60°將移植環(huán)滅菌后,從第二條線末端，順序劃出3-5條線。目的都是使細菌分開形成分散的菌落。,傳統(tǒng)鑒定方法,培養(yǎng)性狀觀察

25、 培養(yǎng)性狀對細菌的鑒定是很重要的。不同屬的植物病原細菌，它們的培養(yǎng)性狀顯然不同。 培養(yǎng)性狀要分別在培養(yǎng)液、瓊膠斜面和瓊膠平板上觀察。描述時，要指明培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等。,,細菌的色素非水溶性色素:水溶性色素:,細菌的形態(tài),革蘭氏染色法,陽性菌——紫色 陰性菌——紅色,鞭毛染色,,,涂片,干燥,固定,,染色1min,水洗、吸干,鏡檢,制備涂片標本→染色,生理和生物化學(xué)性狀,用細菌的培養(yǎng)物接種于一些特定

26、的培養(yǎng)基上或檢測管內(nèi)，通過產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、顏色變化等反應(yīng)，檢測細菌的耐性、好氧或厭氧性、對碳素、氮素和大分子化合物的利用和分解能力等，以達到鑒定的目的。,常見的生化反應(yīng),,對糖的發(fā)酵,,,甲基紅試驗,單糖發(fā)酵試驗,對蛋白質(zhì)的發(fā)酵,,,吲哚試驗,硫化氫試驗,其他試驗,,,尿素酶試驗,枸櫞酸鹽利用試驗,,目前，在傳統(tǒng)測定的基礎(chǔ)上，發(fā)展了測定細菌多項生理生化指標并且借助于計算機統(tǒng)計和決策的快速測定方法。常見的有生化測定試劑盒、Biolo

27、g測定、甲基脂肪酸氣相色譜分析法等。,（2）濃縮接種及離體葉檢測法,把繁殖材料或種子的提取液經(jīng)濃縮后，通過注射、針刺、摩擦、剪葉或噴霧接種等方法，接種到感病植物上觀測是否發(fā)病及其癥狀特點,（3） 噬菌體檢驗,原理：噬菌體侵染細菌，裂解寄主細胞，在固體平板上培養(yǎng)，則出現(xiàn)噬菌斑。噬菌體具有?；?，利用此特點，可鑒別細菌的種類。噬菌體是侵染細菌的病毒，能在活細菌細胞中寄生、繁殖，并裂解寄主細胞。,優(yōu)點：噬菌體法要是簡便、快速，能直接用種子提

28、取液測定。 缺點：非目標菌量多存在時敏感性較差，噬菌體寄生的?；院图毦鷮κ删w的抵抗性，都可能影響檢驗的準確性。,過敏性反應(yīng)——致病性的初步測定,為了確定分離到的大量菌種哪些是致病性的，用常規(guī)接種方法比較費事，有的要經(jīng)過相當長的時間。用植物的過敏性反應(yīng)，來快速篩選致病性細菌。方法是將濃度107/ml的細菌的懸浮液注射在煙草葉片的細胞間致病性細菌往往在6-24h內(nèi)就在注射點周圍出現(xiàn)過敏性枯斑，而腐生性細菌則不表現(xiàn)這種反應(yīng)。注射P

29、seudomonas屬細菌的，一般在6-10h 即出現(xiàn)枯斑，注射 Xanthomonas屬細菌的要10-24h。 煙草、蠶豆葉片也是很好的試驗材料。,,用于植物病原細菌鑒定和檢測的主要方法,2、非活菌檢測,（1）免疫吸附分離檢測法,原理：結(jié)合血清學(xué)與平板分離技術(shù)，利用與抗原高度親和性的抗體，來捕獲目標細菌，樣本中其他細菌均被沖洗掉，再將目標細菌轉(zhuǎn)移或釋放到培養(yǎng)基上生長。方法：平皿免疫吸附評價測定法和免

30、疫吸附稀釋培養(yǎng)法,,,該法可以定性、定量檢測樣品中的抗體或抗原，具有靈敏、簡單、快速等優(yōu)點，已被廣泛地用于植物病原細菌的檢測。,,在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）,免疫熒光抗體測定是先將熒光染料（異硫氰酸熒光黃或羅丹明等）與抗體，以化學(xué)方法結(jié)合起來，形成標記抗體。當與相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，產(chǎn)生有熒光標記的抗體-抗原復(fù)合物。,（2 ）免疫熒光抗體法,熒

31、光染料不影響抗體的免疫特性，但在熒光顯微鏡下，能觀察到黃綠色熒光，熒光的存在就表示抗原的存在。,（3）PCR技術(shù)及其應(yīng)用,PCR的原理,,,,基因組DNA,獲取特定DNA片段,,,,,擴增特定DNA片段,,,,,引物,,,DNA聚合酶,,,,94℃變性,,,50-65℃退火,,,XX℃延伸,72℃,PCR的過程,,,,,,,,,,重復(fù)1~3步25~30輪,目的DNA片段擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,DNA

32、變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,標準的PCR反應(yīng)體系,4種dNTP混合物 各200µmol/L引物 　　　　 　 各10～100pmol模板DNA 　　　 0.1～2µgTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 　　　　　 1.5mmol/L,PCR的特點,靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(µg=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測