1、NT-proBNP,-氨基末端腦鈉肽前體,胡臘英,美國雅培i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀運(yùn)行原理,美國雅培i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀運(yùn)行原理,胡臘英,化學(xué)發(fā)光基本原理,反應(yīng)體系中的某種物質(zhì)的分子(反應(yīng)物、產(chǎn)物、中間體或熒光物質(zhì)) 吸收了反應(yīng)所釋放的能量而由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，然后再從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)，同時(shí)將能量以光輻射的形式釋放出來，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)應(yīng)用于分析化學(xué)，根據(jù)某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來確定體系的相應(yīng)組分含

2、量的分析方法叫化學(xué)發(fā)光分析法。 A + B = C + D*（激發(fā)態(tài)分子） D*→D + hv（激發(fā)態(tài)分子D*的光輻射）,化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)條件,（1）能快速地釋放出足夠的能量 （化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)，DE=170～300 kJ/mol）；發(fā)光位于可見光區(qū)；（2）化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并使之生成激發(fā)態(tài)；（3）激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)。,化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn),由于化學(xué)發(fā)光分析

3、不使用任何光源，避免了背景光和雜散光的干擾，降低了噪聲，大大提高了信噪比，因而，化學(xué)發(fā)光分析法一般都有很高的靈敏度，通?？蓽y(cè)定納克級(jí)或皮克級(jí)的化學(xué)成分。——高靈敏度測(cè)量化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，多采用光電轉(zhuǎn)換裝置，用函數(shù)記錄儀或數(shù)顯裝置，記錄化學(xué)發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度。以最大發(fā)光強(qiáng)度(曲線的峰高)定量被測(cè)組分的濃度?！怆娹D(zhuǎn)換配備微機(jī)系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣，儲(chǔ)存記錄，打印結(jié)果，使化學(xué)發(fā)光分析的速度更快?！詣?dòng),化學(xué)發(fā)光的分類,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)參與的免疫測(cè)定分

4、為二種類型：第一種是以發(fā)光劑作為酶免疫測(cè)定的底物，通過發(fā)光反應(yīng)增強(qiáng)測(cè)定的敏感性。如：化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA，與酶標(biāo)ELISA法類似，即最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑 ） 第二種是以發(fā)光劑作為抗體或抗原的標(biāo)記物，直接通過發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中抗原或抗體的含量。 如：化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定亦稱化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CLIA）、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（ECLI）,ABBOTT i 2000SR檢測(cè)原理,Architect I系統(tǒng)采

5、用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析技術(shù)（Chemiluminesent Microparticle ImmunoAssay, CMIA）檢測(cè)樣品中的抗原，抗體和分析物。即：磁性微粒子包被的捕捉分子（抗原，抗體或病毒顆粒）特異的與被分析物中抗原、抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，再與吖啶酯標(biāo)記的連接物反應(yīng)形成雙抗體夾心抗原抗體復(fù)合物。吖啶酯在過氧化氫的稀堿溶液中發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成10-甲基吖啶酮，當(dāng)它恢復(fù)到基態(tài)時(shí)發(fā)光，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度可計(jì)算出分析物的濃度

6、 。,,CMIA分析成份,磁性微粒子包被的捕捉分子（抗原，抗體或病毒顆粒）用于特異性的檢測(cè)被分析物。 吖啶酯標(biāo)記的連接物 預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液,ABBOTT i 2000SR試劑組成,試劑組成 中圈（RI）：包被有抗體的順磁性微粒子內(nèi)圈（R2）：吖啶酯包被的抗體外圈：樣本稀釋液預(yù)激發(fā)液：1.32%的過氧化氫激發(fā)液：0.35mol./L的氫氧化鈉清洗緩沖液：磷酸鹽緩沖液,R1試劑,R2試劑,CMIA分析步驟,1．

7、樣品與微粒子結(jié)合 在樣品檢測(cè)過程中，微粒子（磁性微粒子包被的捕捉分子）與樣品在反應(yīng)杯中混合，在孵育過程中，樣品中的被分析物與微粒子上的捕捉抗原相互反應(yīng)結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。,,2．磁石將磁性微粒子吸附孵育后，磁石將磁性微粒子（包括特異性的分析物）吸附在反應(yīng)杯的管壁上，反應(yīng)復(fù)合物被清洗去除未結(jié)合的物質(zhì)，然后繼續(xù)進(jìn)行測(cè)定。,,3．加吖啶酯標(biāo)記的連接物 反應(yīng)復(fù)合物在反應(yīng)杯中與吖啶酯標(biāo)記的連接物反應(yīng)結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)復(fù)合物被清洗去除未

8、結(jié)合的物質(zhì)。,,4． 預(yù)激發(fā)液（H2O2）被加入進(jìn)行本底讀數(shù) 預(yù)激發(fā)液具有以下功能：①建立一個(gè)酸性環(huán)境，防止能量的過早釋放（光發(fā)射）②防止微粒子的凝集③將吖啶酯從反應(yīng)復(fù)合物中脫離下來，為吖啶酯的下步反應(yīng)做準(zhǔn)備然后系統(tǒng)在反應(yīng)復(fù)合物中加入激發(fā)液（NaOH），吖啶酯在過氧化物和堿性溶液中發(fā)生氧化反應(yīng)，在堿性H2O2 溶液中，分子受到過氧化氫離子進(jìn)攻時(shí)，生成不穩(wěn)定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解為CO2 和電子激發(fā)態(tài)的N - 甲基吖啶酮

9、，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)出最大發(fā)射波長為430nm 的光子。,,5． 檢測(cè)被分析物存在的量 要檢測(cè)被分析物存在的量，CMIA光路系統(tǒng)通過預(yù)先確定好的時(shí)間讀取化學(xué)發(fā)光發(fā)射的量（活動(dòng)讀數(shù)），可計(jì)算分析物的濃度，或根據(jù)Index（截?cái)嘀担﹣矶ㄐ赃M(jìn)行判斷。,,項(xiàng)目運(yùn)行方法類型,一步法一步法分析需要29分鐘處理時(shí)間,其中包括25分鐘孵育二步法二步法分析需要29分鐘處理時(shí)間,其中包括22分鐘孵育預(yù)先處理法預(yù)先處理法需要對(duì)樣品自動(dòng)預(yù)先處理再按一

10、步法和二步法分析樣品快速反應(yīng)一步法快速反應(yīng)一步法需要18分鐘處理時(shí)間,其中包括11分鐘孵育快速反應(yīng)二步法快速反應(yīng)二步法需要18分鐘處理時(shí)間,其中包括8分鐘孵育,一步法 (i System) 1,? 在位置1加樣品到RV杯中.? 在位置2試劑針R1加微粒子試劑和吖啶酯標(biāo)記的連接物試劑.? 在位置3振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置4-86孵育25分鐘.,一步法 (i System) 2,? 在位置87 - 9

11、0 清洗站2#清洗RV杯混合物吸走沒結(jié)合物質(zhì).,一步法 (i System) 3,? 在位置94加入預(yù)激發(fā)液(Pre-trigger), 然后振動(dòng)混合.? 在位置98 CMIA光學(xué)系統(tǒng)讀空白值, 然后加入激發(fā)液(Trigger), 再測(cè)CMIA光學(xué)系統(tǒng)速率讀數(shù).? 在位置100液體從RV杯中廢液吸走.? 在位置109退出RV杯裝置(UL)推出RV杯道廢物盒.,二步法 (i System) 1,? 在位置1加樣品

12、到RV杯中.? 在位置2試劑針R1加微粒子試劑.? 在位置3振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置4 - 63孵育18分鐘.,共112個(gè)RV杯空位，每18秒轉(zhuǎn)一個(gè)空位，200T/h。常規(guī)28Min/TEST,二步法 (i System)2,? 在位置64 - 67清洗站1#清洗RV杯混合物吸走沒結(jié)合物質(zhì).,二步法 (i System) 3,? 在位置71試劑針R2吖啶酯標(biāo)記的連接物試劑.? 在位置72振動(dòng)混合樣品和試

13、劑.? 在位置73 – 86 孵育4分鐘.,二步法 (i System)4,? 在位置87 - 90清洗站2#清洗RV杯混合物吸走沒結(jié)合物質(zhì).,二步法 (i System) 5,? 在位置94加入預(yù)激發(fā)液(Pre-trigger), 然后振動(dòng)混合.? 在位置98 CMIA光學(xué)系統(tǒng)讀空白值, 然后加入激發(fā)液(Trigger), 再測(cè)CMIA光學(xué)系統(tǒng)速率讀數(shù).? 在位置100液體從RV杯中廢液吸走.? 在位置10

14、9退出RV杯裝置(UL)推出RV杯道廢物盒.,預(yù)先處理法Pretreatment,預(yù)先處理法需要對(duì)樣品自動(dòng)預(yù)先處理再按一步法和二步法分析樣品,目前預(yù)先處理法如下:①7分鐘預(yù)先處理②14分鐘預(yù)先處理,,①7分鐘預(yù)先處理? 在位置1加樣品到RV杯中.? 在位置2試劑針R1加預(yù)先處理試劑.? 在位置3振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置4 - 24孵育7分鐘.? 在位置24樣品針將預(yù)先處理樣品吸到在位置1上新RV杯上.

15、? 按一步法和二步法分析樣品.,,? 在位置24樣品針將預(yù)先處理樣品吸到在位置1上新RV杯上.? 在位置2試劑針R1加預(yù)先處理試劑.? 在位置3振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置4 - 24孵育7分鐘.? 在位置24樣品針將預(yù)先處理樣品吸到在位置1上新RV杯上.? 按一步法和二步法分析樣品.,②14分鐘預(yù)先處理? 在位置1加樣品到RV杯中.? 在位置2試劑針R1加預(yù)先處理試劑.? 在位置3振動(dòng)混合樣品和試

16、劑.? 在位置4 - 24孵育7分鐘.,,ARCHITECT維生素B12項(xiàng)目以一種包含樣本自動(dòng)預(yù)處理的兩步免疫檢測(cè)法，測(cè)定人血清或血漿中的維生素B12。將樣本和預(yù)處理液1、2、3混合。然后，吸取部分預(yù)處理的樣本至新的反應(yīng)杯（RV）內(nèi)。將預(yù)處理的樣本和項(xiàng)目稀釋液、內(nèi)因子包被的順磁微粒子混合。樣本中存在的B12結(jié)合到內(nèi)因子包被的微粒子上。沖洗后進(jìn)入第二步，加入吖啶酯標(biāo)記的B12結(jié)合物。接著向反應(yīng)混合物中加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液；測(cè)量產(chǎn)生的

17、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，以相對(duì)發(fā)光單位（RLUs）表示。樣本中的B12含量與ARCHITECT i光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)到的RLUs值之間成反比。,快速反應(yīng)一步法 (i System) 1,? 在位置47快速反應(yīng)針加樣品到RV杯中.? 在位置48試劑R2針加微粒子和吖啶酯標(biāo)記的連接物試劑.? 在位置49振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置50-86孵育11分鐘.,快速反應(yīng)一步法 (i System)2,? 在位置87 - 90清洗站2#

18、清洗RV杯混合物吸走沒結(jié)合物質(zhì).,快速反應(yīng)一步法 (i System)3,? 在位置94加入預(yù)激發(fā)液(Pre-trigger), 然后振動(dòng)混合.? 在位置98 CMIA光學(xué)系統(tǒng)讀空白值, 然后加入激發(fā)液(Trigger), 再測(cè)CMIA光學(xué)系統(tǒng)速率讀數(shù).? 在位置100液體從RV杯中廢液吸走.? 在位置109退出RV杯裝置(UL)推出RV杯道廢物盒.,快速反應(yīng)二步法 (i System)1,? 在位置47快速

19、反應(yīng)針加樣品到RV杯中.? 在位置48試劑R2針加微粒子和吖啶酯標(biāo)記的連接物試劑.? 在位置49振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置50-63孵育4分鐘.,快速反應(yīng)二步法 (i System) 2,? 在位置64 - 67清洗站1#清洗RV杯混合物吸走沒結(jié)合物質(zhì).,快速反應(yīng)二步法 (i System) 3,? 在位置71試劑針R2吖啶酯標(biāo)記的連接物試劑.? 在位置72振動(dòng)混合樣品和試劑.? 在位置73 – 86

20、孵育4分鐘.,快速反應(yīng)二步法 (i System) 4,? 在位置87 - 90清洗站2#清洗RV杯混合物吸走沒結(jié)合物質(zhì).,快速反應(yīng)二步法 (i System) 5,? 在位置94加入預(yù)激發(fā)液(Pre-trigger), 然后振動(dòng)混合.? 在位置98 CMIA光學(xué)系統(tǒng)讀空白值, 然后加入激發(fā)液(Trigger), 再測(cè)CMIA光學(xué)系統(tǒng)速率讀數(shù).? 在位置100液體從RV杯中廢液吸走.? 在位置109退出RV杯裝

21、置(UL)推出RV杯道廢物盒.,i系統(tǒng)光學(xué)測(cè)量,光學(xué)測(cè)量元件,1. 光學(xué)倍增管 (PMT) 2. CMIA 讀數(shù)器 3. 光路管 4. 激發(fā)液(Trigger)噴頭5. RV杯6. 磁體 7. CMIA 遮光組件,測(cè)量順序,? 閉合遮光組件擋住室內(nèi)光? 打開PMT高壓,讀空白值(預(yù)激發(fā)液(Pre-trigger)已注入), 數(shù)據(jù)傳到CPU .? 將激發(fā)液(Trigger)注入RV杯.? 用光管收集激發(fā)光線射到CMIA讀