1、王振強(qiáng)zhen-qiang wang,男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查與質(zhì)控,,山西省兒童醫(yī)院 婦幼保健院 生殖中心 男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室,不育癥的發(fā)生率為10％－15％，其中約30％由于男性因素引起的，統(tǒng)稱為男性不育癥。男性不育癥患者大部分沒有明顯的臨床癥狀。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是評(píng)價(jià)男性生殖能力的重要手段。,量 2.0ml或更多PH 7.2或更多精子

2、密度 20×106／ml或更多總精子數(shù) 40×106/一次射精或更多活力 射精后60分鐘內(nèi)，50％或更多具有前向運(yùn)動(dòng) （即a+b級(jí)），或25％或更多具有快速前向運(yùn)動(dòng)（a級(jí)）畸形率 ＜ 85％存活率 50％或更多存活白細(xì)胞 ＜1×106／ml 該指標(biāo)參考《WHO人類精液及精子宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)（第四

3、版）,精液分析正常參考值：,正常精子狀態(tài) 射出的精液符合參考值少精子癥 精子濃度低于參考值 (精子密度<20×106／ml或總精子數(shù)<40×106/一次射精)弱精子癥 精子活力低于參考值(a+b級(jí)<50％或a級(jí)<25％)畸精子癥 具有正常形態(tài)的精子少于參考值(正常形態(tài)<15%)少、弱、畸精子癥 表

4、示3種變量均異常（兩種變量異常時(shí)，可用兩個(gè)前綴）無精子癥 所射精液中無精子無精液癥 不射精,精液變量的術(shù)語：,,精子—宮頸粘液相互作用檢測(cè)體內(nèi)試驗(yàn)（性交后試驗(yàn)）PCT1. 時(shí)間選擇 在排卵期進(jìn)行。2. >2天避免性生活,性交后9—12小時(shí)進(jìn)行試驗(yàn).3. 在陰道后穹窿部吸取混合樣本及用另一個(gè)注射器或?qū)Ч芪m頸管內(nèi)的粘液標(biāo)本。將這些標(biāo)本置于載玻片上，加蓋玻片，顯微鏡觀察

5、結(jié)果觀察 性交后9—12小時(shí)進(jìn)行精子活力分級(jí):a，快速直線前向運(yùn)動(dòng)；b，慢或緩慢的前向運(yùn)動(dòng)； C，非前向運(yùn)動(dòng)；d，不活動(dòng)精子。意義:能夠提供精子壽命和存活情況.前向運(yùn)動(dòng)的精子可排除宮頸因素作為不育原因的可能性。,,簡化的玻片試驗(yàn)將一滴宮頸粘液置于載玻片上，用蓋玻片鋪平。載玻片兩側(cè)各滴1滴精液，使其與蓋玻片邊緣接觸，借助于毛細(xì)作用使精液移向蓋玻片下，在宮頸粘液與精液之間形成一個(gè)清晰的接觸界面。

6、該載玻片置于濕潤的溫箱內(nèi)，37孵育30分鐘結(jié)果報(bào)告正常精子穿透粘液90%以上具有直線運(yùn)動(dòng)的精子精子穿透粘液相的距離<500um（約10個(gè)精子的長度）異常精子穿透粘液相，但很快失活或僅作“抖動(dòng)”表示抗精子抗體的存在精子未穿透精液—粘液的接觸界面。,,男性學(xué)組合項(xiàng)目精液分析操作常規(guī)(參照《WHO人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》第四版)精液標(biāo)本采集時(shí)間應(yīng)在禁欲后2-7天。囑病人按《取精指南》在實(shí)驗(yàn)室

7、設(shè)立的取精室內(nèi)采集精液。記錄病人及其妻子姓名、聯(lián)系電話、禁欲時(shí)間、標(biāo)本采集時(shí)間及標(biāo)本分析時(shí)間、采集是否完全。記錄精液總量、PH、液化時(shí)間、液化狀態(tài)、外觀、粘稠度。顯微鏡初檢：用高倍鏡（40×）觀察10個(gè)視野，初步估計(jì)精子密度、活力、精子凝集和非精子細(xì)胞。估記精子密度>40×106/ml時(shí)，用F-10培養(yǎng)液按比例稀釋精液，以避免精子碰撞造成分析錯(cuò)誤。取一滴精液置Hamilton CASA系統(tǒng)進(jìn)行分析。系

8、統(tǒng)設(shè)置：CASA系統(tǒng)溫度設(shè)置為37℃，根據(jù)精子密度選擇Analysis setup: Standard、High density、user-1（低密度精子分析）。應(yīng)選擇精子分布均勻的視野掃描，如精子密度>20×106/ml時(shí)，應(yīng)分析超過400條精子。顯微鏡檢查未見精子的標(biāo)本應(yīng)用3000g離心15分鐘，把所有沉渣重新懸浮成0.2ml，再徹底檢查后發(fā)現(xiàn)無精子，才能作出無精子的判斷。如離心后發(fā)現(xiàn)有精子可按下列公式計(jì)算精子

9、密度。離心后體積×精子密度 精液總量 精子密度（×106/ml） 8． 精子存活率計(jì)數(shù)將新鮮精液與伊紅染液1：1在試管中混勻，30秒后取一滴上述液體置載玻片上并覆以蓋玻片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察?；罹硬恢谰颖蝗境杉t色，觀察200個(gè)精子計(jì)數(shù)存活率。,,男性學(xué)組合項(xiàng)目計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）V

10、CL-曲線速度（μm/s）精子頭沿其實(shí)際的曲線。VSL-直線速度（μm/s）根據(jù)精子頭在開始檢測(cè)時(shí)的位置與最后所處位置之間的直線運(yùn)動(dòng)的時(shí)間平均速度。VAP-平均路徑速度（μm/s）精子頭沿其空間平均軌跡移動(dòng)的時(shí)間平均速度。ALH－精子頭側(cè)擺幅度（μm/s）精子頭沿其空間平均軌跡側(cè)擺的幅度。LIH-直線性。曲線軌跡的直線性。VSL/VCL.WOB-擺動(dòng)性。精子頭沿其實(shí)際軌跡的空間平均路徑擺動(dòng)的尺度。VAP/VCL.STR-前向

11、性?？臻g平均路徑的直線性。VSL/VAP.BCF-鞭打頻率（鞭打次數(shù)、秒）。精子曲線軌跡越過其平均路徑軌跡的時(shí)間平均速度。MAD-平均移動(dòng)角度（度）精子頭沿其曲線軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的時(shí)間平均絕對(duì)值。,,男性學(xué)組合項(xiàng)目9． 精子形態(tài)評(píng)估：涂片取一小滴精液（5 ~ 20 ul）于載玻片上，以另一推片把精液推成薄片，干燥。如果精子密度超過20×106 / ml, 取5μl，精子密度 <20μl ,應(yīng)取10～20μl精液

12、。染色方法采用改良巴氏染色。實(shí)驗(yàn)方法見附2。精子形態(tài)分類在100×油鏡下及10×目鏡分析200條帶尾部的可辨認(rèn)精子的形態(tài)。計(jì)數(shù)百分率。報(bào)告四種類型缺陷：頭部畸型、頸部和中段畸型、尾部畸型、混合畸型。按照第四版精子形態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)，將所有形態(tài)學(xué)處于臨界狀態(tài)的精子均列為異常。在形態(tài)分類的同時(shí)如果見到許多尖頭，需要單獨(dú)記錄。精子形態(tài)分析時(shí)，同時(shí)計(jì)數(shù)非精子細(xì)胞成份，包括未成熟精細(xì)胞和白細(xì)胞等。按下列公式計(jì)數(shù)精液中的非

13、精子細(xì)胞密度。C = N×S 100N= 計(jì)數(shù)100個(gè)精子相同視野中一種特定細(xì)胞類型的數(shù)目。S= 精子細(xì)胞密度（106 / ml）。 C= 特定細(xì)胞類型密度（106 / ml）。,,多重精子缺陷指數(shù)分析 臨床意義：形態(tài)異常的精子經(jīng)常有多種缺陷。在較早的方案中，當(dāng)多種缺陷同時(shí)存在時(shí)，只記錄其中一種，即頭部的缺陷先于中段的缺陷，中段的缺陷先于尾部的缺陷?，F(xiàn)在用一

14、種叫做畸形精子指數(shù)的方法（teratozoospermia index,TZI）或多種異常指數(shù)（multiple anomalies index,MAI），即用缺陷總數(shù)除以畸形精子數(shù)目，以及用精子畸形指數(shù)（sperm deformity index,SDI），即缺陷總數(shù)除以精子總數(shù)。這些參數(shù)預(yù)示精子在體內(nèi)和體外的功能情況。畸形精子指數(shù)的數(shù)值介于1.00（每個(gè)異常精子只有一種缺陷）和3.00（每個(gè)異常精子都有頭、中段及尾部缺陷）之間。報(bào)道

15、提示，畸形精子指數(shù)（TZI）>1.6與未治療不育夫婦的低生育率有關(guān)，精子畸形指數(shù)SDI >1.6提示體外受精失敗的閾值。,精子頂體酶測(cè)定 頂體酶存在于精子頂體內(nèi)膜及赤道部膜上， 是受精過程中重要的蛋白水解酶. 當(dāng)精子頭部進(jìn)入卵透明帶，頂體酶原被活化為頂體酶水解卵透明帶，使精子穿過卵透明帶最終與卵子融合。 頂體酶活性反映精子質(zhì)量，頂體酶活力不足可能導(dǎo)致不育。臨床精子成活率低、死精子癥以及嚴(yán)重

16、生殖系統(tǒng)感染，特別是溶脲支原體嚴(yán)重感染時(shí)可造成精子頂體酶活性降低。 頂體酶活性是判斷男性精子功能和生育力強(qiáng)弱的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。,男性學(xué)組合項(xiàng)目,男性學(xué)組合項(xiàng)目,免疫性不育檢測(cè)指標(biāo):精子膜表面抗體混合凝集反應(yīng)（MAR） 檢測(cè)的是不需要任何處理的精子和免疫珠試驗(yàn)（IBT）檢測(cè)的是經(jīng)洗滌后的精子 陽性 >10%活動(dòng)精子包裹在致敏微球上 MAR是WHO推薦的

17、免疫性不育診斷方法 作為精子膜表面抗體常規(guī)篩選方法,前列腺分泌功能指標(biāo)精漿鋅：與精子活力、抗氧化及前列腺分泌功能有關(guān)精漿檸檬酸：與前列腺分泌功能，精液液化有關(guān)精漿酸性磷酸酶:與前列腺炎有關(guān)精子頂體酶活性定量檢測(cè)判斷男性精子功能和生育力強(qiáng)弱的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，頂體酶活性降低精子將難以穿透卵細(xì)胞從而導(dǎo)致不育。核蛋白組型轉(zhuǎn)換蛋白組型轉(zhuǎn)換缺陷或異?？梢鹉行圆挥蚺咛ピ缙谪舱哿鳟a(chǎn)。,男性學(xué)組合項(xiàng)目二,精子體外處理方法：

18、洗滌法 上游法密度梯度離心法,洗滌法 目的：增加活動(dòng)精子密度和洗去精漿中影響精子活力的物質(zhì)，如白細(xì)胞、細(xì)菌、抗精子抗體等。方法：選用Ham’s F10、HTF、Earle’s等上述任何一種培養(yǎng)液，加10％血清及抗生素。液化精液移于15ml錐形離心管內(nèi)，加3倍劑量的培養(yǎng)液。離心500g×8’，棄上清夜，同法重復(fù)洗滌一次。留沉淀加入0.5ml培養(yǎng)液，制成精子懸液，密度調(diào)整為>40×106/

19、ml,上游法目的： 利用活動(dòng)精子具有主動(dòng)游過液體界面進(jìn)入不同培養(yǎng)液的能力，而達(dá)到自行與死精，凝集精子，畸形精子和細(xì)胞雜質(zhì)分離。 適用于正常精液\液化不良精液。方法：液化精液1：3加入培養(yǎng)液，離心200g×8’，洗滌2次。留沉淀加入0.5ml培養(yǎng)液，制成精子懸液。取另一支試管加入1ml培養(yǎng)液，將0.5ml精子懸液慢慢加入試管底部，形成上下二個(gè)兩面。5％CO2、37℃孵箱內(nèi)靜置1h。

20、收集上游精子，備用,密度梯度離心法目的：利用不同成熟階段的精子和各種細(xì)胞成分各自的密度，差異使之在不同濃度的溶液中，在離心力作用下停留在不同密度面的界面上，達(dá)到較好的分離。適用于精液粘稠、嚴(yán)重少精 弱精癥。 *標(biāo)準(zhǔn)二層Puresperm法(80%、40%) 方法在錐形離心管底依次加入1.5－2ml 80％、40％ Puresperm液。將2ml精液加到40％ Puresperm液界面上，離心300g

21、5;20”棄上層液體、留沉淀物、加5ml Puresperm wash、離心500g×10’同法洗滌2次留沉淀物，加0.5ml SpermAssist制成精子懸液備用。,精液分析在男性生殖力的評(píng)估中 起著極為重要的作用,但是不同實(shí)驗(yàn)室 測(cè)同一份樣本的結(jié)果常有較大差異這說明男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo) 的質(zhì)控是結(jié)果可信度的保證,男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)則隨時(shí)――樣本結(jié)果的監(jiān)測(cè)和對(duì)比；每周――分析不同技術(shù)員

22、所做的主要精液 指標(biāo)的重復(fù)測(cè)量值；每月――分析檢測(cè)結(jié)果的月均值；每季――校正加樣器；每年――校正計(jì)數(shù)板和其他設(shè)備。,質(zhì)控圖的基本控制原則 控制原則 誤差敏感一個(gè)結(jié)果超出處置限 隨機(jī)誤差或系統(tǒng)誤差連續(xù)兩個(gè)結(jié)果都超出警戒上限 系統(tǒng)誤差或

23、低于警戒下限連續(xù)兩個(gè)結(jié)果,一個(gè)高于警戒上限, 隨機(jī)誤差一個(gè)低于警戒下限連續(xù)八個(gè)結(jié)果全部高于或低于均值 系統(tǒng)性誤差,,,,,精子體外存活試驗(yàn) 液化精液1：3加入培養(yǎng)液500×10’ 離心去上清液，重復(fù)洗滌一次。 留沉淀物制成1ml精子懸液，再加入2ml培養(yǎng)液使其形成上下二層界面，37℃、5％CO2孵箱中靜置1小時(shí)。 吸取上清夜，調(diào)節(jié)上游精子密度105—106/ml，活率>95％。

24、37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3天，活率>70%。,培養(yǎng)液、一次性耗材質(zhì)量檢測(cè),小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育實(shí)驗(yàn)常規(guī)促排卵方法處理雌性KM小鼠，注射HCG后雌雄1:1合籠，第二天陰栓陽性的雌鼠留用。實(shí)驗(yàn)前一天，分組準(zhǔn)備培養(yǎng)液，并設(shè)對(duì)照組。標(biāo)記后置37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱平衡過夜。注射hCG 42h左右，頸椎脫臼法處死已見栓雌鼠，無菌條件下獲取2-細(xì)胞胚胎，隨機(jī)分組，每組至少有胚胎20個(gè)。37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72