1、第八章 酶定向進化,（一）教學(xué)目的與要求：　1、掌握：酶定向進化的特點。　2、熟悉：酶基因的隨機突變。　3、了解：酶突變基因的定向選擇。（二）教學(xué)重點：易錯PCR技術(shù)、ＤＮＡ重排技術(shù)、交錯延伸PCR技術(shù)、隨機引物體外重組技術(shù)、基因家族重排技術(shù)概念及特點?！‰y點：酶基因的隨機突變。（三）課時安排：2課時（四）教學(xué)方法：講授法；多媒體教學(xué),,1993年,美國科學(xué)家Arnold F H首先提出酶分子的定向進化的概念,并用于天然

2、酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶.,定向進化,定向進化是模擬自然進化的過程，進行人工隨機突變，并在特定的環(huán)境條件下進行選擇，使進化朝著人們所需要的方向發(fā)展的技術(shù)過程。分為分子定向進化和細胞定向進化,細胞定向進化,細胞定向進化是在細胞水平上進行定向進化的過程，以各種細胞為進化對象，通過人工隨機突變，改良細胞的各種特征，主要包括微生物細胞的定向進化、動物細胞的定向進化、植物細胞的定向進化等。,分子定向進化,分子定向進化是在分子水平上進行定向進化

3、的過程。通過從細胞內(nèi)提取或者通過PCR等方法獲得目標(biāo)分子的基因，在體外進行人工隨機突變，然后進行定向選擇而獲得所需突變體。,酶分子定向進化,簡稱酶定向進化，是模擬自然進化過程（隨機突變和自然選擇），在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過程。,酶定向進化的基本過程,,酶基因,,隨機突變,,構(gòu)建突變基因文庫,,,篩選,,負突變基因,,正突變基因,,進化酶,,

4、,反復(fù)進行,第一節(jié)　酶基因的隨機突變,1、 易錯PCR技術(shù)2、ＤＮＡ重排技術(shù)3、基因家族重排技術(shù)基因隨機突變方法的特點P207表8－1隨機突變方法可以聯(lián)合使用，交叉進行，通過多次試驗，反復(fù)篩選，以完成對酶的定向進化。,一 、易錯PCR技術(shù),從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的情況下進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），使擴增得到的基因出現(xiàn)堿基配對錯誤，從而引起基因突變的技術(shù)過程。　　可以通過提高鎂離子濃度、添加一定濃度的錳離子、改變

5、4種底物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的濃度比等反應(yīng)條件，使DNA聚合酶在催化基因擴增時，增加堿基配對錯誤的出現(xiàn)頻率。,,特點,基因突變發(fā)生在單一分子內(nèi)，為無性進化。操作簡便、隨機突變豐富。正突變的概率低，突變基因文庫較大，文庫篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進化。因此要控制好突變率，一般一個目的基因錯配堿基數(shù)目應(yīng)控制在2~5個,二、 DNA重排技術(shù),由美國Stemmer 于1994 年首次提出一項體外重組技術(shù)

6、概念：又稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫中分離得到同源DNA，用酶切割成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。,,DNA重排技術(shù)的基本過程,,兩條以上正突變基因,,DNA隨機片斷,,突變基因,,構(gòu)建突變基因文庫,,篩選,,負突變基因,,正突變基因,,進化酶,,,酶切,（反復(fù)進行）,無引物PCR,基因重組,酶切,,特點,DNA重排技術(shù)將兩條或多條正突變基因結(jié)合在一起，通過堿基重

7、排形成新的突變基因，為有性進化正突變率高，進化速度較快。（DNA重排技術(shù)是在原有正突變的基礎(chǔ)上進行）操作過程要去除DNase Ⅰ，使操作復(fù)雜化。,,1）交錯延伸PCR技術(shù)： 在同一個反應(yīng)體系中以兩個或多個相關(guān)的DNA片斷為模板進行PCR反應(yīng)，把PCR反應(yīng)中常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短反應(yīng)時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進行，直到產(chǎn)生完整的

8、基因長度。,,交錯延伸PCR技術(shù)特點,省去了用DNA酶切割成片段這一步，簡化了DNA重排方法。交錯延伸法重組發(fā)生在單一試管中，不需分離親本DNA和產(chǎn)生的重組DNA。,,2）隨機引物體外重組技術(shù)采用單鏈DNA為模板，配合若干條隨機序列的引物進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生若干個與模板不同部分的序列互補DNA小片斷，然后除去模板，這些DNA小片斷互為模板和引物進行擴增，通過堿基序列的重新排布而獲得全長突變基因。,,三、基因家族重排技術(shù),概念：又稱為

9、基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNase Ⅰ)切割成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。,基因家族：是來源于同一個祖先，由一個基因通過基因重復(fù)而產(chǎn)生兩個或更多的拷貝而構(gòu)成的一組基因，它們結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)、進化上同源。,,基因家族重排技術(shù)的基本過程,,基因家族若干同源基因,,酶切,DNA隨機片斷,,突變基因,,突變基因文庫,基因重組,,篩選,,負突變基

10、因,,正突變基因,,進化酶,無引物PCR,,,酶切,反復(fù)進行,DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的異同點,相同點：DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的過程大致相同，都要經(jīng)過基因的隨機切割、無引物PCR等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過構(gòu)建突變基因文庫、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。不同點： DNA家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源基因出發(fā)進行DNA序列的重新排布，而DNA重排技術(shù)則從采用易錯PCR等技術(shù)所獲得的兩個以上的正突變基因出

11、發(fā)進行DNA序列的重新排布。,第二節(jié) 酶突變基因的定向選擇,突變基因的定向選擇基本過程,突變基因,基因載體,,,,突變基因文庫,基因重組,,篩選,,目的基因,一 、酶突變基因文庫的構(gòu)建,（一）構(gòu)建基因文庫的質(zhì)量要求1、文庫的包容性:指構(gòu)建的文庫必須盡可能地包含基因的任何一種可能的突變信息。2、文庫的完整性：指文庫中包含的DNA片斷必須盡可能完整地反應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，以便通過篩選得到的突變基因能夠通過表達獲得完整的具有催化功能的

12、進化酶。,（二）構(gòu)建突變基因文庫的主要過程,1、載體的選擇載體的基本特點:能自主復(fù)制；具有2個以上的遺傳標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。,1）質(zhì)粒載體：質(zhì)粒載體是人工改造后的質(zhì)粒，具有自主復(fù)制起點、兩種以上易于檢測的選擇性標(biāo)記、多種限制性內(nèi)切酶的單一位點等特點。,,. ori 復(fù)制起點.tctr　四環(huán)素基因.Ampr

13、 氨芐青霉素抗性基因.P 啟動子T　終止子,（二）構(gòu)建突變基因文庫的主要過程,2）噬菌體DNA載體：由噬菌體DNA改造而成的具有自我復(fù)制能力的載體。3）黏粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有λDNA黏性末端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱為柯斯質(zhì)粒。4）噬菌粒載體：是一類人工構(gòu)建的由M13噬菌體單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體。,2、基因重組,在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過程

14、。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接,,,,黏性末端,黏性末端,,EcoRI限制酶的切割,,,被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。,,平末端　　　平末端,SmaI限制酶的切割,,當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。,3、形成基因文庫,將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞或包裝成有感染活性的噬菌體的過程。重組質(zhì)粒載體

15、：轉(zhuǎn)化重組噬菌體DNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白將重組DNA進行包裝，稱為有感染活性的重組噬菌體，而形成基因文庫。,二、突變基因的篩選,（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定（1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細胞，每一次突變－篩選的循環(huán)中逐步提高重組細胞的培養(yǎng)溫度。（2）如果定向進化的目的是提高β－內(nèi)酰胺酶的活性，從而提高對β－內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受性，可以通過在含有一定濃度的β－內(nèi)酰胺酶類抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細胞，并在每一次突變－篩選

16、循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。（二）高通量篩選技術(shù)P217表8－2,1、 平板篩選法,平板篩選法所依據(jù)的重組細胞的表型包括細胞生長情況、顏色變化情況、透明圈情況。1）依據(jù)細胞生長情況篩選突變基因在提高酶的熱穩(wěn)定性、抗生素耐受性、pH穩(wěn)定性和對其他極端環(huán)境條件的耐受能力等方面有廣泛應(yīng)用。,2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因,（1）在采用噬菌體DNA載體構(gòu)建突變基因文庫時，可以用大腸桿菌β－半乳糖苷酶的基因片斷（lacZ′）插入到噬菌體DNA

17、的間隔區(qū)域中，當(dāng)它感染了相應(yīng)的大腸桿菌宿主細胞時，在含有IPTG和底物X－gal的平板培養(yǎng)基上可以形成藍色噬菌斑。（2）在對磷酸酯酶進行定向進化的過程中，可以在平板培養(yǎng)基中加入硝基酚磷酸，接種重組細胞培養(yǎng)一段時間后，有些重組細胞周圍出現(xiàn)黃色（硝基酚）。,3）依據(jù)透明圈情況篩選突變基因,依據(jù)透明圈情況篩選突變基因是在平板培養(yǎng)基中加入目的酶的作用底物，然后接種重組細胞，在一定條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，在一些重組細胞的菌落周圍會出現(xiàn)較