1、MicroRNA在腫瘤及白血病中的研究進展,RNA的種類及主要功能,NON-CODING RNA: FORMERLY KNOWN AS “JUNK”,RNA Transcripts,Protein-coding mRNA,Non-coding RNA Transcripts,Regulatory RNAmiRNAsiRNAAnti-sense RNA,snoRNAs,Housekeeping RNAs,tRNArRNAsnRN

2、AtmRNAsRnase P RNAsvRNAsgRNAsMRP RNAsSRP RNAsTelomerase RNA,Transcription/chromatin structure regulatorsTranscriptional regulatorsProtein function modulatorsRNA/Protein localization regulators,MiRNA定義：,微小RNA(mi

3、croRNA, miRNA)是一種長度約為22-28 nt的非編碼小分子RNA，miRNA通過與靶mRNA 3’UTR(Untranslated Regions,即非翻譯區(qū)，是mRNA分子兩端的非編碼片段)完全或不完全的互補結合，導致靶mRNA降解或翻譯抑制，從而調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡。它們通過miRNA介導的特異性的基因沉默導致靶mRNA降解及抑制蛋白質的合成調控轉錄后基因表達水平。miRNA對細胞的增殖、分化和

4、凋亡有重要的調節(jié)作用。,MiRNA特征：,MicroRNA是一種長度約為21nt的單鏈非編碼小分子RNA。在進化過程中高度保守。其通過與靶基因序列的3’UTR區(qū)特異性結合，誘導靶mRNA 降解或阻遏其翻譯。MiRNA預計調控超過60%的蛋白編碼基因并且參與近乎所有已知的細胞進程。,miRNAs的發(fā)現,1993年，miRNA由哈佛大學Victor Ambros和Gary Ruvkun首次發(fā)現 (lin-4)2000年，第二個miR

5、NA Let-7 在由哈佛大學博士后 Frank Slack 發(fā)現(Ruvkun lab),Victor Ambros,Gary Ruvkun,miRNA的研究思路,miRNA的研究方法,1. miRNA芯片技術,將目前已經克隆的miRNA或潛在miRNA制備成探針固定在尼龍膜或其它固相支持物上，然后與不同組別的總RNA或細胞器RNA雜交，通過信號的強弱比較探討miRNA 的表達狀況。 該方法類似于基因芯片技術，具有

6、高通量、快速等優(yōu)點，是目前疾病相關miRNA篩選常用的一種技術。,qRT-PCRNorthern Blot原位雜交技術等RNA-seq,miRNA芯片是目前篩選和研究miRNA調控的高通量手段,RNA-seq 是另一種高通量研究方法,RNA-Seq: a revolutionary tool for Transcriptomics，Nature,2009,10:57,有些miRNA具有類似抑癌基因功能，通過轉錄后負性調控致瘤性靶

7、基因的表達而發(fā)揮生物學功能；有些miRNA具有類似癌基因的作 用，通過下調抑瘤性靶基因的表達而發(fā)揮功能。,惡性腫瘤的microRNA結構與表達異常,惡性腫瘤相關性microRNA,如果組織中某種或某些miRNA的表達失常，細胞內許多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就會受到異常調控而表達失常，從而導致腫瘤的發(fā)生 。,有些miRNA具有類似抑癌基因功能，通過轉錄后負性調控致瘤性靶 基因的表達而發(fā)揮生物學功能；有些miRNA具有類似癌基因的作 用

8、，通過下調抑瘤性靶基因的表達而發(fā)揮功能。,惡性腫瘤的microRNA結構與表達異常,惡性腫瘤相關性microRNA,如果組織中某種或某些miRNA的表達失常，細胞內許多起重要作用的瘤基因或抑瘤基因就會受到異常調控而表達失常，從而導致腫瘤的發(fā)生 。,原癌基因與抑癌基因,原癌基因（proto-oncogene ）?癌基因(oncogene)Myc抑癌基因(cancer suppressor gene)p53,miR-21 （1）m

9、iR-21在乳腺癌、肝癌、腦瘤等多種惡性腫瘤中表達顯著上 調，并與乳腺癌等腫瘤的惡性分級呈正相關；（2）miR-21 可能通過抑制其靶基因 TPM1(tropomyosin 1)的表達而促進膠質瘤細胞的增殖。 （3）miR-21通過負調控抑癌基因PTEN的表達，促進肝癌細胞的增殖和侵襲能力 。（4）通過抑制PCD4 (programmed cell death 4) mRNA的翻譯效率，抑制MCF-7的增殖。

10、,（一）致瘤性microRNA （onco-miRNA）,在microRNA (miRNA)家族中，有些miRNA具有類似癌基因功能，與腫瘤發(fā)生呈正相關，這部分miRNA稱為致瘤性miRNA（onco-miRNA），其過表達或持續(xù)活化將直接導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。,let-7 家族 (1) Let-7是2000年由Reinhart等在線蟲中發(fā)現的一種具有轉錄后調節(jié)作用的miRNA，通過轉錄后調節(jié)lin-47和lin-51的表達而控制

11、線蟲向成蟲的轉變。(2) Ras 是Let-7的直接靶基因，受到let-7家族的負性調控。Ras是 一個膜相關的GTPase信號蛋白，具有調節(jié)細胞生長、分化 的功能，是一個重要的瘤基因。(3) 在肺癌、乳腺癌、子宮癌等惡性腫瘤中，let-7家族與這些腫 瘤有關的脆性位點密切相關，在肺癌中其表達下調，是一個 與肺癌預后負相關的抑癌基因。,（二）抑瘤性microRNA (suppressor m

12、iRNA),在miRNA 家族中，有些miRNA具有類似抑癌基因功能，與腫瘤發(fā)生呈負相關，稱為抑癌性miRNA（suppressor miRNA）。抑癌性miRNA的表達下降或者缺失，將直接導致腫瘤的形成。,17,miRNA與腫瘤發(fā)生的關系存在兩種可能的模式 [Caldas, et al.（Nature Medicine 2005）] ：1、若miRNA表達上調，其對應抑癌基因表達下調時，則可能導致腫 瘤發(fā)生；2、若mi

13、RNA表達下調，其對應癌基因表達上調時，同樣可能導致腫 瘤發(fā)生。,癌癥相關 miRNAs 舉例,惡性腫瘤microRNA的轉錄調控異常,（轉錄因子-microRNA-靶基因”交互作用的分子網絡）,1．轉錄因子對microRNA初級轉錄產物的調控,2. microRNA對靶基因的調控,大部分miRNA具有自己一套獨立的順式作用元件（啟動子和增強子序列），受到上游一系列轉錄因子的調控。類似于蛋白編碼基因的轉錄過程，這些轉錄因

14、子通過與miRNA的順式作用元件結合，調節(jié)miRNA在轉錄水平的表達。,miRNAs與其靶基因3’-UTR的結合位點并不是完全互補，可以存在短的錯配和G-U配對，因此，miRNA調控多個靶基因。同時，同一個靶基因又同時受到多個miRNA的調控。 miR-21 →TPM1、PCD4和PTEN ；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195 → bcl-2,因此，一個轉錄因子可以調控多個miRNA分子，一個miRNA分子又同時

15、受到多個轉錄因子的調控；同時，一個miRNA分子能調控多個靶基因，而一個靶基因又同時受到多個miRNA分子的協(xié)同調控；它們之間組成了錯綜復雜的調控網絡，實現了對人體生命活動以及疾病發(fā)生發(fā)展和轉歸過程的精細調控。,3．“轉錄因子-microRNA-靶基因”構成復雜的分子網絡,microRNA與腫瘤的診斷和治療,腫瘤的分子診斷與治療是分子醫(yī)學的重要組成部分，已成為當前腫瘤研究領域的熱點。一些具有重要診斷和治療價值的分子標志物已經在臨床上

16、得到了廣泛的應用，但由于特異性、敏感性或靶向性等方面的因素，其臨床應用仍然受到很大局限 。由于miRNA在腫瘤多階段發(fā)生過程中具有獨特的表達特征和生物學功能，miRNA在腫瘤的分子診斷和治療中具有廣泛應用前景。,一、microRNA與腫瘤的診斷,(一) 腫瘤組織特異性表達標志物,miRNA 表達特征來對腫瘤進行分類，并且篩選能對腫瘤進行預后評估的miRNA標記。,Lu等通過對多種組織來源腫瘤組織miRNA（約200個）表達譜進行歸類

17、，發(fā)現這些結果與腫瘤組織的胚胎來源一致。例如，內皮起源腫瘤，如直腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一類，血液系統(tǒng)來源的也被歸為一類。而16000個蛋白編碼基因的mRNA則不能將其聚在同一類。因此，腫瘤的miRNA表達特征反映了其發(fā)育起源，這也與miRNAs 指導組織特異性發(fā)育功能相一致。,1. 腫瘤的miRNA表達特征反映了其發(fā)育起源,許多的研究通過miRNA芯片技術系統(tǒng)研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血

18、病等腫瘤組織與其正常組織中的差異表達，構建了相應腫瘤組織與正常組織差異miRNA表達譜，篩選出了一些具有臨床診斷價值的分子靶標。 如，miR-221、miR-301和miR-376a診斷胰腺癌。,(2) miRNA指導臨床腫瘤診斷,（3）miRNA非常穩(wěn)定,福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品中分離出來，這使得miRNA表達譜特征庫的建立成為可能。,(二) 腫瘤血清標志物,血清的獲得相對比較簡單、對病人創(chuàng)傷少，因此腫瘤血清標志物越來越受到廣大

19、醫(yī)學研究者青睞。,（1）miRNA在血漿和血清中非常穩(wěn)定，它們被有效保護以避免接觸RNases，在嚴酷的環(huán)境條件下仍能保持穩(wěn)定。（2）miRNA在血漿和血清中穩(wěn)定性使得其實際值與在病人身上得到的測試值非常吻合。,第一個被發(fā)現的血清miRNA標志物是miR-21。Lawrie等人證實，彌漫性大B細胞淋巴瘤病人的血清miR-21水平很高，與淋巴瘤存活率呈負相關，是一個淋巴瘤預后預測的理想分子靶標。,二、microRNA與腫瘤治療,（1）

20、microRNA (miRNA)具有重要的生物學功能，參與腫瘤 的發(fā)生發(fā)展； （2）miRNA序列短，操控簡單，基因藥物容易導入到宿主體 內，從而逆轉腫瘤的惡性生物學行為，達到治療腫瘤的 目的。 （3）根據miRNA的生物學功能，可以從癌基因和抑癌基因的 角度設計針對性藥物對腫瘤進行治療。,針對致瘤性miRNA設計藥物： 人工合成的反義寡聚核苷

21、酸----抗miRNA寡聚核苷酸（AMOs）在滅活具有癌基因特性的miRNA表達，逆轉腫瘤細胞惡性生物學行為等方面取得了很大的突破。動物實驗結果表明，與膽固醇偶聯(lián)的AMOs注射小鼠后，可以在小鼠的不同器官有效抑制靶miRNA活性，抑制腫瘤的生長和惡性生物學行為。 針對抑瘤性miRNA設計藥物： 利用病毒或者脂質體可以瞬時引入大量具有抑瘤基因的miRNA （如let-7 家族）。這些技術可以保證在某些組織特異性的啟