1、中國藥典 高效液相色譜,,1,,定義,高效液相色譜法 系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。 注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi),各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。,2,一、對儀器的一般要求和色譜條件,所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定,3,儀器包括： 儲液器

2、 泵 進樣器 色譜柱 檢測器,色譜柱,反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。,4,色譜柱,填充劑的性能（如載體的形

3、狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10µm之間。粒徑更?。s2µm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）。,5,注意,以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，

4、為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃流動相的PH值應(yīng)控制在2~8的。當PH大于8時，可使載體硅膠溶解；當PH小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH值大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑當需使用PH值小于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基

5、硅烷鍵合硅膠填充劑,6,檢測器,最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以

6、同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。,7,檢測器,紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)符合紫外—可見分光光度法（附錄V A）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并

7、選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。,8,二極管陣列檢測器 （diode array detector，DAD）,特點：在任一時間內(nèi)，均可同時得到物質(zhì)在不同波長下的吸收情況，即三維圖譜,多 組 分 混 合 物 的 三 維 圖 譜,,,,,流動相,反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少

8、用含有緩沖液的流動相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。,14,二、系統(tǒng)適用性試驗,色譜系統(tǒng)的適用性試驗通包括理論板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子 分離度和重復(fù)性是尤為重要。,15,色譜柱的理論板數(shù)(n),用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采

9、用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）,按n＝16（tR/w）2或n=5.54(tR/Wh/2) 2計算色譜柱的理論板數(shù)。,16,分離度(R),用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離

10、程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標?？梢酝ㄟ^測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內(nèi)標物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當?shù)姆椒ń到猓ㄟ^測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。,17,,無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。除另外有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計算公

11、式為： 2(tR2－tR1) 2(tR2－tR1)R＝─────── 或 R＝────────── W1＋W2 1.70（ W1，h/2＋W2,h/2）式中 t R2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中

12、前一峰的保留時間；W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結(jié)果為準。,18,重復(fù)性,用于評價連續(xù)進樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0％；采用內(nèi)標法時，通常配制相當于80％、100％和120％的對照品溶液，加入規(guī)定量

13、的內(nèi)標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差也應(yīng)不大于2.0％。,19,拖尾因子（T）,用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為： W0.05hT＝────── 2d1式中 W0.05h為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法

14、定量時T應(yīng)在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應(yīng)在各品種項下對拖尾因子作出規(guī)定。,20,測定法,(1)內(nèi)標法 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： As／Cs校

15、正因子（f）＝───── AR／CR式中 As為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高； Cs為內(nèi)標物質(zhì)的濃度； CR為對照品的濃度。,21,,再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量： Ax含量（Cx）＝

16、f·───── As內(nèi)／Cs內(nèi)式中 Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； Cx為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度； As內(nèi)為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高；Cs內(nèi)為內(nèi)標物質(zhì)的濃度；f為較正因子。,22,,（2）外標法：按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按

17、下式計算含量 含量（cX）=cR(AX/AR) 式中各符號意義同上。 由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或或自動進樣器進樣為好。,23,,（3）面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只能用于粗略考察供

18、試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。,24,美國藥典第24版,通法中的高效液相色譜法，簡要說明了本法的特點，指出了本法用于大多數(shù)藥物分析是以分配色譜法為基礎(chǔ)，可在30min內(nèi)完成。敘述分儀器和方法兩部分。在儀器項下，詳細分述了泵系統(tǒng)、進樣器、柱、檢測器和數(shù)據(jù)收集裝置。關(guān)于檢測器，重點討論了常用的分光光度檢測器。對于配有單色器的可變波長檢測器的波長準確度，應(yīng)該用該儀器制造廠提供的方法進行校正，如果觀察到的波長與正

19、確的波長相差3nm以上，則提示需進行再校正。,25,,美國藥典還討論了多波長檢測器，特別是二極管陣列多波長檢測器的特點，指出，二極管陣列檢測器比固定波長檢測器或可變波長檢測器的信噪比低，不適宜于低濃度化合物的分析。在討論示差折光檢測器中，認為該檢測器不如紫外光檢測器靈敏，且受溶劑組成、流速、溫度變化的影響大，要得到滿意的基線，需用參比柱。在方法項下，強調(diào)要用高純度的試劑和HPLC級的有機溶劑，色譜用水的電導(dǎo)率和紫外吸收應(yīng)低，并指出，流

20、動相的組成對容量因子的影響遠大于溫度的影響。本部分還討論了梯度洗脫的應(yīng)用、檢測器的線性動態(tài)范圍（即檢測器信號響應(yīng)與被測成分量呈比例的范圍）、自動進樣測定、外標法和內(nèi)標法測定和系統(tǒng)適用性試驗。在通法中還有專門一節(jié)討論系統(tǒng)適用性試驗。,26,英國藥典2000年版,附錄ID 液相色譜法，簡要敘述了儀器、方法、歸一化法、效能及與正文有關(guān)的內(nèi)容。在方法項下，說明要用對照溶液測試，以決定儀器的設(shè)置和獲得適當響應(yīng)的注樣量，進行重復(fù)進樣以驗證重復(fù)性，必

21、要時，還要檢測理論板數(shù)。除另有規(guī)定外，測定被測物峰的峰面積。若被測物峰的對稱因子為0.8-1.2，也可測定峰高。在應(yīng)用梯度洗脫時，則測定峰面積。在歸一化項下，說明在用歸一化法測定時最好使用寬范圍放大器和自動積分儀。相鄰兩峰的分離度以半高寬和保留時間的公式計算，對稱因子的計算公式與中國藥典中的拖尾因子公式相同，并列出了容量因子計算公式和信噪比測定法。在與正文有關(guān)內(nèi)容項下，建議流動相要經(jīng)脫氣，脫氣裝置應(yīng)不影響流動相的組成；,27,,正文

22、規(guī)定的定量方法如果不是內(nèi)標法，建議用固定體積的定量環(huán)進樣器；色譜柱通常為不銹鋼柱，其尺寸規(guī)定在正文中（長度和內(nèi)徑）；正文中規(guī)定的固定相如以字母表示，即指本節(jié)所附的固定相，該固定相的粒度在字母后的括號內(nèi)寫明，有時標明適用牌號，并不等于別的牌號不能用。本節(jié)所附的固定相有：固定相A為硅膠顆粒，固定相B為表面化學(xué)鍵合辛烷基硅烷的硅膠顆粒，固定相C為表面化學(xué)鍵合十八烷基硅烷的硅膠顆粒。除另有規(guī)定外，色譜分離是在恒定的室溫下進行，光度檢測器的