1、1,Activin A、Inhibin A在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義,專 業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué) 研究生：李紅云 導(dǎo) 師：黃鳳英副教授,2,主要內(nèi)容,第二章 材料與方法,第三章 結(jié) 果,第四章 附 圖,第五章 討 論,第一章 前 言,第六章 結(jié) 論,3,第一章 前 言,前 言,4,研 究 背 景,前 言,5,子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)，簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，是指具有活性的子宮內(nèi)

2、膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外部位。,,前 言,6,內(nèi)異癥是育齡期婦女的多發(fā)病、常見(jiàn)病,不孕,月經(jīng)異常、盆腔包塊,痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛,影響生活質(zhì)量,前 言,7,其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，且復(fù)發(fā)率高，治療棘手，國(guó)內(nèi)外婦產(chǎn)科學(xué)者一直在努力探索其發(fā)病機(jī)制，以利于這一疾病的治療而成為婦產(chǎn)科醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。,,前 言,8,,,內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制現(xiàn)有學(xué)說(shuō),,,,內(nèi)異癥,誘導(dǎo)學(xué)說(shuō),免疫學(xué)說(shuō),子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō),其他學(xué)說(shuō),體腔上

3、皮化生學(xué)說(shuō),3A模式學(xué)說(shuō),淋巴及靜脈播散學(xué)說(shuō),前 言,9,“3A模式學(xué)說(shuō)”：月經(jīng)期返流的子宮內(nèi)膜需要黏附（Attachment）、侵襲（Aggression），并誘導(dǎo)新生血管形成（Angiogenesis），最終發(fā)展成為有臨床癥狀的疾病。,,前 言,,,生根,生病,生長(zhǎng),內(nèi)異癥,10,前 言,“免疫學(xué)說(shuō)”認(rèn)為：內(nèi)異癥是一種自身免疫性疾病，機(jī)體免疫功能逐漸減退，子宮內(nèi)膜細(xì)胞如同腫瘤細(xì)胞一樣可能發(fā)生免疫逃逸，對(duì)異位內(nèi)膜細(xì)胞

4、的特異性免疫減弱，免疫監(jiān)視、清除異位細(xì)胞能力下降，使異位內(nèi)膜得以存活、增殖并導(dǎo)致局部纖維增生、粘連。,,11,,,前列腺,,,,,,,生殖組織,非生殖組織,,,,,,,,,,,,腦,,,胎盤,,,子宮內(nèi)膜,,,胰腺,,,腎臟,,,骨髓,,,,,,,,睪丸,垂體,肝臟,腎上腺,Activin A(激活素A)是一種主要由性腺分泌的大分子糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族球蛋白成員。,,,前 言,,卵巢,,12,,,粘附性↑

5、,Activin A,纖維連接蛋白,結(jié)締組織生長(zhǎng)因子↑,,,侵襲性↑,Activin A,上皮型鈣粘蛋白↓，MMP-2、3、7、9和 白血病抑制因子↑,,,,Activin A,,促進(jìn)增殖,,促進(jìn)血管形成,前 言,13,,內(nèi)異癥是具有類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為的良性病變,子宮內(nèi)膜細(xì)胞的粘附、侵襲、增殖能力及血管形成對(duì)內(nèi)異癥的發(fā)病具有極其重要的作用，Activin A雖具有以上生物學(xué)作用,但是目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Activin A的研究

6、主要集中在PCOS、子癇前期、卵巢腫瘤等婦產(chǎn)科疾病和內(nèi)科的纖維增生性疾病,而其在內(nèi)異癥方面的研究并不多,僅國(guó)外少數(shù)學(xué)者有研究,國(guó)內(nèi)尚無(wú)內(nèi)異癥方面的研究。,,前 言,14,,,前 言,Inhibin A（抑制素A）與Activin A一樣，同是大分子糖蛋白，也屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族球蛋白成員。,15,最初對(duì)其生物學(xué)作用的認(rèn)識(shí)是反饋性抑制垂體FSH的分泌并影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其也具有生長(zhǎng)因子樣作用

7、，在組織再生中調(diào)控組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,而且Inhibin A在細(xì)胞免疫中也起作用。而Inhibin A在內(nèi)異癥方面的研究，雖國(guó)外已有報(bào)道，但國(guó)內(nèi)尚處于空白階段。,,前 言,16,二者在內(nèi)異癥的表達(dá)如何？是否對(duì)內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展起作用？二者是否存在相互關(guān)系？都值得我們研究和探討。,,？,前 言,17,研 究 目 的,前 言,18,免疫組化SP法,檢測(cè)Activin A和Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對(duì)

8、照組正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)。,探討Activin A和Inhibin A在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用及相互關(guān)系。,,,前 言,19,第二章 材料與方法,材料與方法,20,各組患者年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，月經(jīng)周期規(guī)則，無(wú)其他內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。,異位內(nèi)膜（32例）,在位內(nèi)膜（32例）,增生期16例,分泌期16例,增生期18例,分泌期16例,增生期16例,分泌期16例,輸卵管吻合術(shù)、不孕癥（輸卵管因素）、卵

9、巢囊腫。,,,,正常內(nèi)膜（34例）,研 究 對(duì) 象,,Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期21例,材料與方法,,對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組,21,主要儀器,普通光學(xué)顯微鏡TGW16高速微型離心機(jī)DR28429精密可調(diào)微量移液器微波爐BL-220H電子天平4 ℃冰箱,LGE-10-400H超純水機(jī) 蓋玻片 載玻片 移液器管咀 塑料修復(fù)盒,材料與方法,22,主要試劑,即用型封閉用兔血清 即用型封閉用羊血清 濃縮型羊抗人Activin A多克

10、隆抗體 即用型兔抗人Inhibin A多克隆抗體 濃縮型兔抗羊IgG-HRP 即用型羊抗兔IgG-HRP 辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液 AEC顯色試劑盒 蘇木素 甘油明膠,30%過(guò)氧化氫 檸檬酸緩沖液 EDTA抗原修復(fù)液 二甲苯 無(wú)水乙醇 松節(jié)油 無(wú)水磷酸氫二鈉 氯化鉀 磷酸二氫鉀 氯化鈉,材料與方法,23,組織切片,切片常規(guī)脫蠟至水化,滴加3%H2O2室溫10分鐘,滴加封閉用血清工作液,室溫1

11、0-15分鐘,傾去,勿洗,高壓抗原修復(fù),滴加一抗工作液，4℃過(guò)夜,滴加二抗工作液,室溫10-15分鐘,AEC顯色劑顯色,蘇木素復(fù)染,封片,鏡檢,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫10～15分鐘,實(shí)驗(yàn)步驟,材料與方法,24,染色強(qiáng)度 無(wú)著色 0淺著色 1中等著色 2強(qiáng)著色 3,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50% 3,免疫組化積分,+,免疫組化結(jié)果判定,=,Activin A和Inh

12、ibin A蛋白的陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒,用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,PBS代替一抗作陰性對(duì)照。,,材料與方法,25,統(tǒng)計(jì)分析,材料與方法,,,,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的兩組間的均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩測(cè)量指標(biāo)的相關(guān)性采用pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)

13、水準(zhǔn)α=0.05(雙尾)，P<0.05表示有顯著性差異。,26,第三章 結(jié) 果,結(jié) 果,27,Activin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,28,Activin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,29,Activin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,30,Activin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,31,Activin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,32,Inhibin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,33,Inhibin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,34,Inhibi

14、n A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,35,Inhibin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,36,Inhibin A蛋白的表達(dá),結(jié) 果,37,Activin A與Inhibin A相關(guān)關(guān)系,圖3-11 Activin A蛋白和Inhibin A蛋白在異位內(nèi)膜中表達(dá)的相關(guān)性分析,圖3-11 Activin A蛋白和Inhibin A蛋白在在位內(nèi)膜中表達(dá)的相關(guān)性分析,圖3-11 Activin A蛋白和Inhibin A蛋白在正常內(nèi)膜中表

15、達(dá)的相關(guān)性分析,r=0.925，P＜0.05,r=0.924，P＜0.05,r=0.893，P＜0.05,,呈正相關(guān)關(guān)系,結(jié) 果,38,第四章 附 圖,附 圖,39,圖5正常子宮內(nèi)膜增生期,以下圖片為HE染色，×200,圖6正常子宮內(nèi)膜分泌期,圖3內(nèi)異癥在位內(nèi)膜增生期,圖4內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分泌期,圖1內(nèi)異癥異位內(nèi)膜增生期,圖2內(nèi)異癥異位內(nèi)膜分泌期,附 圖,40,以下圖片為免疫組化AEC染色，×200,,,,,附

16、 圖,圖7 Activin A蛋白在前列腺增生癥組織中的陽(yáng)性表達(dá)（陽(yáng)性對(duì)照）,圖8 Activin A蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的陰性表達(dá)（陰性對(duì)照）,圖11 Activin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜增生期呈陽(yáng)性表達(dá),圖12 Activin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分泌期呈陽(yáng)性表達(dá),,圖9 Activin A蛋白在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜增生期呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),,圖10 Activin A蛋白在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜分泌期呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),41,以下圖片為免疫

17、組化AEC染色，×200,,,附 圖,圖15 Inhibin A蛋白在腎上腺皮質(zhì)腺瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)（陽(yáng)性對(duì)照）,圖16 Inhibin A蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的陰性表達(dá)（陰性對(duì)照）,,圖13 Activin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織增生期呈弱陽(yáng)性表達(dá),,圖14 Activin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織分泌期呈弱陽(yáng)性表達(dá),,圖17 Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥異位內(nèi)膜增生期呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),,圖18 Inhibin A蛋白在內(nèi)

18、異癥異位內(nèi)膜分泌期呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),42,以下圖片為免疫組化AEC染色，×200,,,附 圖,圖19 Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜增生期呈陽(yáng)性表達(dá),圖20 Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分泌期呈陽(yáng)性表達(dá),,圖21 Inhibin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織增生期呈弱陽(yáng)性表達(dá),,圖22 Inhibin A蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織分泌期呈弱陽(yáng)性表達(dá),43,第五章 討 論,討 論,44,Activin A、Inhib

19、in A均為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族球蛋白成員。,,,Inhibin α,InhibinβA,InhibinβA,InhibinβA,-S-S-,-S-S-,Activin A,Inhibin A,,討 論,Activin A和Inhibin A的結(jié)構(gòu),45,細(xì)胞粘附性,細(xì)胞侵襲性,細(xì)胞增殖,血管形成,Activin A,,,,,,,Activin A的作用,討 論,纖維連接蛋白、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子↑,VEGF和VEGF受體

20、↑，作為自分泌因子增強(qiáng)VEGF的作用,上皮型鈣粘蛋白↓MMP-2、3、7、9和白血病抑制因子↑,旁分泌作用,,,,46,,,,,,異位,在位,正常,Activin A在各組內(nèi)膜的表達(dá),,,各組內(nèi)膜都能產(chǎn)生Activin A,與國(guó)外學(xué)者Reis和Mabuchi的研究結(jié)果相似。,,內(nèi)異癥組異位和在位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜能產(chǎn)生更多的Activin A,說(shuō)明其在內(nèi)異癥的發(fā)病中可能起作用,與Rombauts的研究結(jié)果一致。,討 論,,,

21、,Activin A在異位內(nèi)膜高表達(dá)可能通過(guò)增加細(xì)胞粘附性、侵襲性、增殖能力，并促進(jìn)血管形成而促進(jìn)內(nèi)異癥發(fā)生。佐證了“3A發(fā)病模式”。,47,,,Activin A蛋白在正常內(nèi)膜:分泌期＞增生期,與Ciarmela的研究結(jié)果一致,提示分泌期的子宮內(nèi)膜細(xì)胞較增生期子宮內(nèi)膜細(xì)胞能產(chǎn)生更多的Activin A。我們還發(fā)現(xiàn)：Activin A蛋白在內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜：分泌期＞增生期，提示Activin A蛋白在

22、腺上皮細(xì)胞中的周期性表達(dá)似與卵巢激素的周期性分泌相關(guān),可能與雌、孕激素的調(diào)節(jié)有關(guān)。,,,Activin A在月經(jīng)周期的表達(dá),討 論,48,推測(cè),,與病情嚴(yán)重程度相關(guān),,,Ⅲ～Ⅳ期＞Ⅰ～Ⅱ期,隨著內(nèi)異癥病變的發(fā)展，異位病灶與周圍組織器官形成過(guò)度纖維化，可導(dǎo)致瘢痕形成、慢性盆腔疼痛以及受累的組織器官功能減弱甚至散失，為卵巢異位囊腫的臨床特征之一。,研究表明Activin A能通過(guò)促進(jìn)Ⅰ型膠原的表達(dá)促進(jìn)肝纖維化、腎纖維化、

23、肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。,已有研究證實(shí)Ⅰ型膠原是內(nèi)異癥纖維化最主要的因子。,Activin A在不同臨床分期的表達(dá),,Activin A也可能通過(guò)增加Ⅰ型膠原的表達(dá)促進(jìn)內(nèi)異癥纖維化進(jìn)展，從而加重病情,是內(nèi)異癥發(fā)展中的一個(gè)重要因素。,,討 論,49,,,Findlay研究發(fā)現(xiàn)Inhibin與Activin、TGF-β、巨噬細(xì)胞游走抑制因子等都是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員,具有自分泌、旁分泌生長(zhǎng)因子活性，參與垂

24、體、性腺、胎盤等多種組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。,Inhibin A可減少Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合物(MHCⅡ)的表達(dá),MHCⅡ是抗原呈現(xiàn)和T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體活化所必需的,其表達(dá)減少則導(dǎo)致T細(xì)胞反應(yīng)降低,從而降低免疫反應(yīng),而且Inhibin A還可抑制免疫活性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的補(bǔ)充和活化,Inhibin A的作用,討 論,50,,不僅如此，我們的結(jié)果還表明內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜較在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜能產(chǎn)生更多的Inhib

25、in A，在位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜也能產(chǎn)生更多的Inhibin A，可能是內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的原因之一。,,表明各組內(nèi)膜都能產(chǎn)生Inhibin A,與國(guó)外學(xué)者Reis、Akande的研究結(jié)果一致。,Inhibin A在各組內(nèi)膜的表達(dá),,,異位,在位,正常,,,,討 論,51,生長(zhǎng)因子樣作用,降低免疫反應(yīng),Inhibin A異位內(nèi)膜高表達(dá),,,內(nèi)異癥的發(fā)生,討 論,,,52,,本研究發(fā)現(xiàn)Inhibin A蛋白在各組內(nèi)膜的表達(dá)：分泌期

26、＞增生期,與Anderson和Klein的研究結(jié)果一致，提示Inhibin A分泌高峰在黃體期。,Inhibin A在月經(jīng)周期中的表達(dá),,討 論,53,,本研究結(jié)果還顯示Inhibin A蛋白在內(nèi)異癥Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)強(qiáng)于Ⅰ～Ⅱ期。提示內(nèi)異癥患者Inhibin A蛋白表達(dá)水平與內(nèi)異癥的進(jìn)展有關(guān)。,Inhibin A在不同臨床分期的表達(dá),,討 論,54,Activin A與Inhibin A的相互關(guān)系,,,,,,我們的實(shí)驗(yàn)：二者

27、在各組內(nèi)膜均存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）,Activin A,Inhibin A,Activin A和Inhibin A在內(nèi)異癥發(fā)病中可能存在協(xié)同作用，但具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究探討。,,,討 論,55,第六章 結(jié) 論,結(jié) 論,56,1 Activin A和Inhibin A在內(nèi)異癥表達(dá)增強(qiáng)，提示Activin A和Inhibin A可能參與內(nèi)異癥發(fā)病；2 Activin A和Inhibin A在各組子宮內(nèi)膜組

28、織中的表達(dá)與月經(jīng)周期有關(guān)；3 Activin A和Inhibin A的表達(dá)與內(nèi)異癥臨床分期有關(guān)，提示二者可能參與內(nèi)異癥的發(fā)展；4 Activin A和Inhibin A在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有協(xié)同作用。,,,,,結(jié) 論,57,致 謝 三年的碩士生涯馬上就要過(guò)去，回憶起這三年的點(diǎn)點(diǎn)滴滴，感觸很深，在此，我要衷心的感謝每一位關(guān)心和幫助過(guò)我的人們！

29、 首先衷心感謝我敬愛(ài)的導(dǎo)師黃鳳英副教授對(duì)我學(xué)習(xí)、工作上的悉心教導(dǎo)和生活上的關(guān)心和照顧。恩師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、縝密的科學(xué)思維、淵博的知識(shí)、高尚的醫(yī)德、精湛的醫(yī)術(shù)和對(duì)事業(yè)執(zhí)著的追求，是我終生學(xué)習(xí)的榜樣。每次回想起恩師為了學(xué)生的事情不辭辛苦，哪怕是白天辛苦一天，晚上再晚也不忘為我們的事情操勞，我的心就一次次被震撼著，恩師，謝謝您！您很偉大！我們很幸福！能成為您的學(xué)生是我這一生莫大的財(cái)富！ 衷心感謝中南大學(xué)湘雅二醫(yī)

30、院婦產(chǎn)科的方小玲、劉鳳英、吳宜林、張洪文、陶光實(shí)、朱付凡、丁依玲、張麗娟、劉毅智、施曉波、黃健、符淳、鄧文、王新、皮丕湘、吳獻(xiàn)青、范紅、聶妹芳、彭梅、王麗瓊、喻玲、鄧婭莉、丁暉、宋婉娟、花蘭、李菡、楊元娟、熊晶、章婷婷、施華芳、徐潤(rùn)芝、鄒燕輝等各位老師對(duì)我學(xué)習(xí)和生活的指導(dǎo)和關(guān)心。感謝婦科全體老師在我實(shí)驗(yàn)收集標(biāo)本中給予的大力幫助！ 衷心感謝中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院病理科老師對(duì)我的幫助與支持！ 衷心感謝師姐劉秋紅、鄒穎

31、、王煥萍、劉玉娟、邵文靜，師妹胡柏帆，同學(xué)楊倩、賀艷麗、劉曉旭、王常青在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的熱情幫助！ 衷心感謝在百忙之中抽出時(shí)間審閱本論文的專家教授，感謝答辯委員會(huì)的各位老師和專家們對(duì)我的論文提出的寶貴建議！ 衷心感謝我的愛(ài)人和我的親人在學(xué)習(xí)上和生活中對(duì)我的理解、支持與幫助！ 衷心感謝各位患者在課題實(shí)施過(guò)程中對(duì)我的支持！ 再次衷心感謝所有幫助過(guò)我的良師益友和親人們！,向答辯委員會(huì)主席、