1、雞新城疫的實驗室診斷及免疫效果的評價,目的1、掌握雞新城疫的臨診要點。2、了解和掌握雞新城疫的實驗室診斷和免疫監(jiān)測技術(shù)。,內(nèi)容1、雞新城疫的臨診要點。2、雞新城疫的實驗室診斷。 NDV的分離及鑒定； NDV毒力的鑒定3、雞新城疫的免疫效果評價,雞新城疫的免疫監(jiān)測 血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI),血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗 (HI),HA和HI的原理⒈HA試驗：許多病毒表面有血凝素，

2、能與各種動物的紅細(xì)胞表面受體結(jié) 合，而出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡稱為病毒的血凝現(xiàn)象 。2.HI試驗：病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，可以被特異性免疫血清所抑制，稱HI試驗。,一、雞新城疫的血凝試驗(HA),【材料】 新城疫病毒雞胚接種尿囊液 1份 0.5％雞血球懸液 1管 生理鹽水或PBS

3、 1瓶 96孔微量血清盤 1塊 微量加樣器 1支,一、雞新城疫的血凝試驗(HA),【方法與步驟】（一）制備雞紅細(xì)胞懸液：1.用注射器抽取抗凝劑。  2.用上述注射器，采用無菌法抽取健康的未免疫雞的靜脈血。3.混勻，加生理鹽水適量，洗滌離心，共離心三次（第一、二次2000轉(zhuǎn)/分5

4、分鐘、第三次3000轉(zhuǎn)/分 5分鐘）洗去血清及白細(xì)胞。⒋ 取純紅細(xì)胞0.6ml，加生理鹽水稀釋99.4ml，即成1%的雞紅細(xì)胞懸液。,一、雞新城疫的血凝試驗(HA),（二）加樣,1. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50?L生理鹽水。2. 于左側(cè)第1孔加50?L病毒液，混合均勻后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50?L；第12孔為紅細(xì)胞對照。3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 雞紅細(xì)胞懸液50?L，在振

5、蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果。,一、雞新城疫的血凝試驗(HA),【病毒血凝試驗的操作方法（單位：?L）】,,以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位,一、雞新城疫的血凝試驗(HA),【 結(jié)果判定 】置于振蕩器上振蕩1分鐘，靜置后30 min開始觀察結(jié)果，待對照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100% 凝集（++++），不凝集者（-）紅細(xì)胞沉于孔底呈點狀。以100%

6、 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位。從表4-1看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。,二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI),【材料】 除血球凝集試驗所用材料外，血清取雞免疫血清。,雞群卵黃抗體的制備,1.取雞蛋卵黃20ml，加入等量生理鹽水，振蕩，搖勻。2.加入等

7、量氯仿40ml，振蕩30分鐘。3.取振蕩的卵黃液3000～4000rpm30分鐘。4.取上清液作為抗體檢測材料,二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI),【方法】1. 根據(jù)HA試驗結(jié)果，確定病毒的血凝價，配制出4個血凝單位的病毒液。2. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，先在第1孔加50?L生理鹽水。3.自第3孔至12孔各加50?L 4個血凝單位的新城疫病毒液。4.第１孔加被檢雞血清50?L，吹吸混合均勻，吸50

8、?L至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50?L，稀釋度分別為：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫陽性血清50?L，作為血清對照。振蕩混合均勻，置室溫中作用20min 。5. 自第l孔至12孔各加0.5% 雞紅細(xì)胞懸液50?L，振蕩混合均勻，室溫下靜置30-40min后觀察結(jié)果,二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI),【病毒血凝抑制試驗的操作方法（單位：?L） 】,以100％抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血