1、RNA干擾技術(shù)基本原理與應(yīng)用,,什么是RNA干擾,RNA干擾(RNA interference，RNAi),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使目的基因的不表達(dá)或表達(dá)水平下降.,2001、2002年連續(xù)被Science評為年度十大成就!,目前應(yīng)用的基因干擾技術(shù),DNA水平的基因干擾技術(shù)基因敲除技術(shù)寡核苷酸與雙鏈

2、DNA 雜交采用多胺等小分子識別并阻遏特定轉(zhuǎn)錄因子,目前應(yīng)用的基因干擾技術(shù),mRNA水平的基因干擾技術(shù)用反義RNA 技術(shù)阻遏翻譯過程, 破壞內(nèi)源性mRNA設(shè)計(jì)寡核苷酸來破壞與mRNA 結(jié)合的蛋白質(zhì), 使mRNA 不穩(wěn)定雙鏈RNA 干擾技術(shù)（RNAi）,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,1984 年,Jonathan 研究小鼠L 細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)反義mRNA 會(huì)干擾同源基因的表達(dá)，機(jī)制不清1990年 Jorgensen等 矮牽牛顏色加深實(shí)

3、驗(yàn) “共抑制(co-suppresion)”,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反義RNA阻斷秀麗小桿線蟲par-1基因的表達(dá) 實(shí)驗(yàn) 首次發(fā)現(xiàn) RNA干擾現(xiàn)象1998年 Andrew Fire和Craig Mello 發(fā)現(xiàn)單鏈RNA抑制作用較弱，而純化的dsRNA可高效、特異地抑制基因的表達(dá) Nature1998；

4、 391: 806-11 正式提出RNA干擾的概念,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,1999年 Tuschl等 報(bào)道在哺乳動(dòng)物中也存在RNAi2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特異性的阻斷效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)分解dsRNA 為siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶,RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程,2002 年

5、Novina 等 用RNAi 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對HIV-1 病毒的阻抑2004年 Morris 等 用RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對人細(xì)胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-1292,RNAi的主要特點(diǎn)和優(yōu)勢,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默具有高度的特異性抑制基因表達(dá)的高效性可在不同細(xì)胞之間傳遞甚至傳到子代中去 “基因沉默系統(tǒng)化”,siRNA 與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶,

6、共同點(diǎn) 特異性 靶向性,siRNA 與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶,不同點(diǎn)獨(dú)特的雙鏈結(jié)構(gòu)需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等協(xié)同因子siRNA 本身無催化活性在細(xì)胞內(nèi)可能具有相對的穩(wěn)定性具有一定的可遺傳性,RNAi的主要過程,啟動(dòng)階段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNA長度：21-25nt結(jié)構(gòu)：3ˊ端懸垂兩個(gè)未配對的堿基UU,細(xì)胞中內(nèi)源性

7、dsRNA的形成,基因組中DNA 反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同時(shí)轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA 病毒RNA 復(fù)制中間體以單鏈RNA 為模板由細(xì)胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA,Dicer酶,RNAase III超家族成員。結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合位點(diǎn)對單鏈RNA沒有活性對200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA廣泛存在,Rd

8、Rp（RNA dependent RNA polymerase）,使異常的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA參與細(xì)胞內(nèi)dsRNA和siRNA的擴(kuò)增siRNA與靶mRNA 的結(jié)合可激活RdRp，形成大量的dsRNA,RNAi的主要過程,效應(yīng)階段RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成RISC的激活：ATP依賴的解雙鏈過程在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下(靶序列的識別），RISC特異性切

9、 割、降解靶mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)失活,RNAi技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法,siRNA的設(shè)計(jì)原則序列大小 19-21nt ，最好以A或G開始從mRNA的AUG開始，尋找AA二連序列，作為潛在的RNAi靶位點(diǎn)不要針對5‘和3’端非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs),RNAi技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法,siRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)2~4個(gè)序列, BLAST 比對基因序列以確保序列設(shè)計(jì)的特異性優(yōu)先選擇 GC 含量30-50%的序列設(shè)

10、計(jì)適當(dāng)?shù)年幮詫φ招蛄?陰性對照序列的設(shè)計(jì),特異性siRNA中的堿基進(jìn)行隨機(jī)排列，且行BLAST基因比對 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特異性siRNA引入1~2個(gè)錯(cuò)配堿基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG,目標(biāo)序列篩選的相關(guān)網(wǎng)站,http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shili

11、n/rnai.htmlhttp://sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp://biotools.idtdna.com/rnai/http://RNAiDesigner.invitrogen.comhttp://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/http://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html,查找已經(jīng)證實(shí)的siRNA

12、的網(wǎng)站,http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.htmlhttp://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.htmlhttp://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Cat

13、egory=Published,siRNA的制備方法,體外制備方法化學(xué)合成siRNA體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA利用Dicer或 RNaseⅢ消化長的dsRNA成siRNA,化學(xué)合成法制備siRNA,優(yōu)點(diǎn)： 純度高 合成量不受限 能被標(biāo)記缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴、合成周期長用途：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究,體外轉(zhuǎn)錄法制備siRNA,優(yōu)點(diǎn)：簡單 成本低 速度快 毒性小 穩(wěn)定性好 缺點(diǎn)：反應(yīng)規(guī)模和量始終

14、有一定的限制用途：篩選siRNAs，特別是需要制備多種 siRNAs,siRNA的制備方法,細(xì)胞內(nèi)制備方法依賴表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞內(nèi)獲取siRNA通過PCR介導(dǎo)的siRNA表達(dá)試劑盒獲取siRNA,siRNA載體,依賴RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III) ，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。人源U6啟動(dòng)子 鼠源的U6啟動(dòng)子 人H1啟動(dòng)子pol III可在細(xì)胞中表達(dá)許

15、多的小分子RNA，通過添加一串（3~6個(gè)）U來終止轉(zhuǎn)錄的需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈再克隆到載體中,表達(dá)載體法制備siRNA,優(yōu)點(diǎn)：可以進(jìn)行較長期研究。載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因達(dá)數(shù)星期或更久缺點(diǎn)：需要進(jìn)行克隆，周期長，質(zhì)粒載體表達(dá)效率較低用途：唯一可以用于長期基因沉寂研究的方法,基于PCR的siRNA表達(dá)框架(SECs),組成：RNA pol III啟動(dòng)子 發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA

16、 RNA pol III終止位點(diǎn)制備：PCR ，無需克隆和測序,用SECs制備siRNA,優(yōu)點(diǎn)：可直接由PCR得到，方法簡便，時(shí)間短在PCR片段兩端添加酶切位點(diǎn)，篩選出 最有效的siRNA可用于構(gòu)建表達(dá)載體可以用來篩選特定研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配,用表達(dá)框架制備siRNA,缺點(diǎn)：PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時(shí)可能產(chǎn)生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想 用途：

17、篩選siRNA序列在將siRNA克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子,shRNA(short hairpin RNA) 文庫,Nature 2004 ；428： 427 - 431 (25 March) 針對：9,610 human genes 5,563 mouse genes 構(gòu)建成：28,000個(gè)shRNA表達(dá)盒(cassettes)商品化試劑盒：Expression Arrest?(美

18、國冷泉港實(shí)驗(yàn)室 Open Biosystems公司) 網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中選擇特定的shRNA克隆，無需再耗時(shí)耗力進(jìn)行siRNA的設(shè)計(jì)、合成和驗(yàn)證過程,CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重組位點(diǎn)Barcode：每個(gè)shRNA獨(dú)特的識別序列 MSCV：病毒載體骨架 PKG-Puro：哺乳動(dòng)物細(xì)胞中載體穩(wěn)定性的選擇Kan、oriT、RK6：逆轉(zhuǎn)錄病毒信號序列,siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,.磷酸鈣共沉淀 電穿孔法 DEA

19、E-葡聚糖和polybrene 機(jī)械法 ：顯微注射和基因槍 陽離子脂質(zhì)體試劑,提高轉(zhuǎn)染效率的方法,純化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染 較低傳代數(shù)的細(xì)胞 合適的轉(zhuǎn)染試劑 合適的陽性對照熒光標(biāo)記的siRNA,RNAi技術(shù)的應(yīng)用,基因組功能研究的新方法研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑 開展基因治療的新策略 （抗病毒、抗腫瘤等）篩選藥物靶點(diǎn)的新工具,RNAi技術(shù)抗病毒,作用阻止病毒入侵、抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄自然界中

20、普遍存在在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰質(zhì)炎病毒DNA病毒：如HBV,RNAi技術(shù)阻止HIV的入侵,Novina將針對CD4的dsRNA導(dǎo)入 能表達(dá)CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 細(xì)胞系），能使細(xì)胞表面CD4 表達(dá)減少75%；轉(zhuǎn)染后60 小時(shí)后, 再用H IV 感染, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4-siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞很少有包涵體出現(xiàn)其它試驗(yàn)的受體： CCR 5、CXCR4,RNAi技術(shù)抑制HIV的