1、血清蛋白電泳——醋酸纖維素薄膜法（定性）,實(shí)驗(yàn)二,電泳技術(shù)分光光度技術(shù)層析技術(shù)離心技術(shù),生物化學(xué)的四大研究技術(shù)：,電 泳 技 術(shù),帶電粒子在電場中向電極相反方向移動的現(xiàn)象，稱為電泳。電泳技術(shù)即是利用樣品中各種帶電粒子的帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品分子進(jìn)行分離、鑒定、純化和制備。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)多用于分離，純化、鑒定蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。,Kaurin Tiselius (190

2、2-1971)因研究電泳和吸附分析，特別是發(fā)現(xiàn)關(guān)于血清蛋白的復(fù)雜本質(zhì)而獲獎1948諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。,1809年，俄國物理學(xué)家Peиce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象；1937年，Kaurin Tiselius 發(fā)明了Tiselius電泳儀，建立了自由界面電泳，首次證明人血清蛋白的組分；1948年，Wieland和Fischer以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳；1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成凝膠作為介質(zhì)——聚丙烯酰胺凝膠電泳

3、:生物大分子的“Last Check”！,電泳的影響因素：1、影響電泳遷移率的外界因素：電場強(qiáng)度溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象2.影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：所帶凈電荷的量大小和形狀,電泳的分類,根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為： 自由界面電泳 區(qū)帶電泳根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)分為： 連續(xù)pH電泳 不連續(xù)pH電泳按支持物的裝置形式不同分為：

4、 水平板式電泳 垂直板式電泳 垂直柱式電泳根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為： 細(xì)胞電泳，核酸電泳，蛋白質(zhì)電泳等按其介質(zhì)的物理性狀不同可分為： 凝膠電泳 粉末電泳 線絲電泳 纖維膜電泳等,血清醋酸纖維素薄膜電泳,基 本 原 理,本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持介質(zhì)，分離各種血清蛋白。蛋白質(zhì)是兼性離子。由于組成蛋白質(zhì)分子的氨基酸種類和數(shù)目不同，各種血清蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)也不相同。

5、故在同一條件下，它們電泳速度各不相同，因而可以分離。方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。,由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條區(qū)帶，每條帶

6、代表一種蛋白質(zhì)，按泳動快慢順序，各區(qū)帶分別為清蛋白、α1-球蛋白、 α2-球蛋白、 β-球蛋白和γ-球蛋白。 經(jīng)洗脫比色觀察不同蛋白質(zhì)的區(qū)帶。,試劑 巴比妥緩沖液，染色液，漂洗液材料 血清，醋酸纖維素薄膜器材 電泳儀，培養(yǎng)皿，點(diǎn)樣器，玻璃板 粗濾紙，鉛筆，加樣槍，鑷子等。,試劑和耗材,操作步驟,1. 準(zhǔn)備 醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理： 將薄膜小心放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使其漂浮

7、在液面；用鑷子輕壓，使其全部浸入緩沖液內(nèi)。待膜完全浸透（約半小時）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時分辨出光滑面和粗糙面。 標(biāo)記：在粗糙面上用鉛筆距薄膜條一端2cm處劃線即為點(diǎn)樣線并作好標(biāo)記。,2. 點(diǎn)樣（關(guān)鍵） 在薄膜的粗糙面點(diǎn)樣。點(diǎn)樣時，先用吸管將3微升血清均勻地涂在點(diǎn)樣器表面，再用點(diǎn)樣器“印”在薄膜的點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，樣品呈線狀，寬約1~2mm。,,注意：點(diǎn)樣時動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，

8、以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果 。另外操作過程要防止指紋污染。,3. 電泳 將點(diǎn)樣后的薄膜使粗糙面（點(diǎn)樣面）向下，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，貼在電泳槽支架的“濾紙橋”上，平衡5min。 打開電源，調(diào)節(jié)電壓和電流強(qiáng)度。調(diào)節(jié)電壓至90-100V左右，電流強(qiáng)度為0.4～0.6mA/cm薄膜條寬，電泳時間40min-1h左右。,1.濾紙橋 2.電泳槽 3.醋酸纖維素薄膜 4.電泳槽膜支架 5.電極室中央隔板,

9、4. 染色 電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。5. 漂洗 用漂洗液漂洗，不停擺動薄膜條，每3-5min左右換一次液，連續(xù)更換三次，可使背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。 操作中，注意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。,分清薄膜的點(diǎn)樣面注意點(diǎn)樣樣品的寬度和力度注意薄膜放置的方向控制染色及漂洗時間保持良好的實(shí)驗(yàn)秩序,6、注 意 事

10、項(xiàng),預(yù)期結(jié)果 一般的染色后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的五條區(qū)帶。從正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。,1、洗脫法：,,思考： 如何設(shè)置洗脫法 的空白對照？,各蛋白組分的定量,2、光密度計(jì)掃描法,血清中各蛋白組分的含量,臨床意義,急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2 和β球蛋白升高；慢性活動性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高；急性炎癥：α1、α

11、2球蛋白升高；慢性炎癥：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高；紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：白蛋白降低，γ球蛋白顯著升高；多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β 和γ球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M”帶。,小 結(jié),1、本次課重要概念、原理。2、結(jié)合基本原理和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合分析實(shí)驗(yàn)操作中存在的問題。3、醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)操作的細(xì)節(jié)及影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。4、電泳結(jié)果與臨床意義。,思考題,利用本次實(shí)驗(yàn)課所學(xué)知識，分析以下表格中個各蛋白質(zhì)的混