1、2024/3/20,,,興奮劑的檢測(cè)方法 之免疫分析法,小組成員：魯夢(mèng)霞、熊晴、閆曉玉、潘存麗,2024/3/20,興奮劑的檢測(cè)方法 之免疫分析法,一、興奮劑的概念二、免疫分析法 （1）酶聯(lián)免疫分析法 （2）放射免疫分析法 （3）化學(xué)發(fā)光分析法,2024/3/20,一、興奮劑的概念,1964年，國(guó)際運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)會(huì)的國(guó)際興奮

2、劑會(huì)議將興奮劑的概念定義為: 參加競(jìng)賽的運(yùn)動(dòng)員使用任何異體物質(zhì)，或以不正常的量和不正常的進(jìn)入機(jī)體的途徑使用生理物質(zhì)，試圖人為地以不正當(dāng)方式提高其競(jìng)賽成績(jī)的行為。,2024/3/20,,興奮劑檢測(cè)的主要方法有氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用、免疫分析法、流動(dòng)注射電化學(xué)發(fā)光、高效毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳－離子阱質(zhì)譜等方法。,2024/3/20,二、免疫分析法,免疫分析法是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)禁

3、用藥物的檢測(cè)的方法。 特點(diǎn)：快速、高靈敏度、高特異性。 應(yīng)用：主要被應(yīng)用于類固醇類興奮劑和激素類興奮劑的檢測(cè)。,2024/3/20,,分類： （1）酶聯(lián)免疫分析( enzyme－linkedimmunosorbent assay，ELISA) （2）化學(xué)發(fā)光免疫分析( chemiluminescence immunoassay，CIA) （3）放射免疫分析( radioimmunoassay，R

4、IA),二、免疫分析法,2024/3/20,,1、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA),2024/3/20,,1、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA),2024/3/20,通過(guò)在合適的載體上酶標(biāo)一定量的抗原與未知抗原競(jìng)爭(zhēng)固相抗體結(jié)合位點(diǎn)，形成抗體復(fù)合物。在一定底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解氧化或還原成另一種帶色物質(zhì)，由于酶的降解產(chǎn)物與顯色成正比，因此可通過(guò)酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定，從而確定是否存在未知抗原及其含量。,酶聯(lián)免疫分析法——原理,2024/3/

5、20,酶聯(lián)免疫分析法——原理,2024/3/20,,,酶聯(lián)免疫分析法——特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：快速 特異性強(qiáng) 分析容量大 安全可靠應(yīng)用：適用在現(xiàn)場(chǎng)篩選和大量樣本的快速檢測(cè),2024/3/20,酶聯(lián)免疫分析法——應(yīng)用1,Daniel 等用酶聯(lián)免疫分析法多項(xiàng)檢測(cè)，定性、定量檢測(cè)了蛋白同化激素。這個(gè)方案結(jié)合不同的交叉反應(yīng)性與分布多元數(shù)據(jù)分析技術(shù)的多元競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)。用新型k-

6、最近鄰分類法分析了主成分。這個(gè)方案可以同時(shí)檢測(cè)四種濃度范圍為0.1 - 316.2nmol/L不同的類固醇，甚至在交叉反應(yīng)的前提下總的檢測(cè)正確率也可達(dá)90.6%。,2024/3/20,,,酶聯(lián)免疫分析法——應(yīng)用1,2024/3/20,酶聯(lián)免疫分析法——應(yīng)用2,Eva M 等將牛血清白蛋白多克隆抗體與孕三烯酮3 - 羧甲基羥胺耦合，創(chuàng)建了兩種高靈敏度、特異的檢測(cè)孕三烯酮的酶聯(lián)免疫分析法。實(shí)驗(yàn)A，半抗原蛋白涂層條件下的檢測(cè)限為0.09

7、77;0.03ng.L-1。實(shí)驗(yàn)B，在共軛蛋白涂層的條件下，檢測(cè)限可達(dá)到0.14±0.05 ng.L-1。兩個(gè)免疫測(cè)試都具有高特異性，與其他合成代謝類固醇沒(méi)有任何交叉反應(yīng)。一般條件下的可運(yùn)用于未預(yù)處理的尿液樣本中類固醇的檢測(cè)，回收率可達(dá)到76~122%。,2024/3/20,酶聯(lián)免疫分析法——應(yīng)用2,2、放射免疫分析法(RIA),簡(jiǎn)介 1959 年美國(guó)的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核素標(biāo)記胰島素從而創(chuàng)

8、立了放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)。 定義:把放射性核素測(cè)定與抗原、抗體間的免疫化學(xué)反應(yīng)兩種方法巧妙地結(jié)合起來(lái)所形成的一種超微量物質(zhì)的測(cè)定方法。,2024/3/20,,,2、放射免疫分析法(RIA),,建立在標(biāo)記抗原(*Ag)和非標(biāo)記抗原(Ag)對(duì)限量的特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。*Ag與 Ag 具有等同的與Ab結(jié)合能力。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)可用下式表示：

9、 *Ag  +  Ab?*Ag-Ab + Ag

10、 ? Ag-Ab,放射免疫分析法——原理,RIA反應(yīng)示意圖,用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物Ag和一定量的*Ag及限量的Ab反應(yīng)，隨著Ag增加， *Ag與Ab結(jié)合的少，二者變化如右圖所示。游離的*Ag為F, *Ag-Ab為B。,,放射免疫分析法——原理,標(biāo)準(zhǔn)曲線,,B／(B+F

11、)與Ag的量存在 著函數(shù)關(guān)系，繪制得標(biāo) 準(zhǔn)曲線。將未知濃度 樣品按同樣條件操作， 所得結(jié)合率(％)與標(biāo)準(zhǔn) 曲線相比，即可得出樣 品中待測(cè)抗原的濃度。 注：T=B+F,放射免疫分析法——原理,優(yōu)點(diǎn)： 1.靈敏度高，其最小檢測(cè)值可達(dá)ng至pg水平; 2.特異性強(qiáng):由于抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，該方法具

12、有很強(qiáng)的特異性不需要對(duì)樣品進(jìn)行提純即可直接測(cè)定; 3.重復(fù)性好、準(zhǔn)確性佳、快速簡(jiǎn)便，免除了煩瑣的化學(xué)提純步驟； 4. 藥盒種類多、標(biāo)本和試劑用量少，測(cè)定方法易于規(guī)范化和自動(dòng)化等。,放射免疫分析法——特點(diǎn),缺點(diǎn)： 1.檢測(cè)中有放射性污染，對(duì)操作人員有一定的輻射損害； 2.放射性廢物處理上的困難和對(duì)環(huán)境有一定的污染；,放射免疫分析法——特點(diǎn),甲基苯丙胺(MA)屬于苯丙胺類興奮劑，作用于

13、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有藥物依賴性及毒理學(xué)特性，是我國(guó)最為嚴(yán)重的濫用毒品之一。 甲基苯丙胺(MA)及其代謝物自尿排出體外，可以通過(guò)檢測(cè)尿液中的苯丙胺類興奮劑及其代謝物來(lái)認(rèn)定吸毒者。通過(guò)建立甲基苯丙胺放射免疫分析法 ，采用碳化二亞胺法制備甲基苯丙胺半抗原，免疫兔使其產(chǎn)生相應(yīng)的抗體與Na125I標(biāo)記抗原組成試劑盒，檢測(cè)人體體液中的甲基苯丙胺(MA)。,放射免疫分析法——應(yīng)用（尿液中苯丙胺類興奮劑的檢測(cè)）,1天分8個(gè)時(shí)間段，上、下午

14、各采四次，每組間隔45min；收集的尿液在-20℃保存待檢驗(yàn),,,取尿液于小離心管中，離心，取上清液供RIA分析,取50μL樣品、100μL 1:600抗血清和100μL 125I-MA;37℃孵育45min，加分離劑500μL，放置15min，以3000r·min-1離心15min，抽干。,1、采樣,2、樣品前處理,3、檢測(cè),,4、結(jié)果,γ一記數(shù)儀記數(shù)，并自動(dòng)計(jì)算尿中MA濃度(ng·ml-1),放射免疫分析法——應(yīng)

15、用,,2024/3/20,,,3、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）,1977年Halman將化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)相結(jié)合，創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA )，以檢測(cè)抗原或抗體。CLIA是建立放射免疫分析技術(shù)(RIA)基礎(chǔ)上的免疫分析技術(shù)，既有免疫反應(yīng)的特異性，更兼有發(fā)光反應(yīng)的高敏感。,2024/3/20,,,3、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）,2024/3/20,,化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類,即直接化學(xué)發(fā)光免疫

16、分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,3、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）,2024/3/20,,,該方法用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體(化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原、磁顆粒性的抗原或抗體反應(yīng)，通過(guò)磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài) (沉淀部分)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開(kāi)來(lái)，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。,化學(xué)發(fā)光免疫分析法——原理,2024/3/20,發(fā)光,Y,Y,,Y,,,磁微

17、粒,,被測(cè)抗原,+,抗體,+,,帶吖啶酯標(biāo)記物抗體,,,,,,沖洗后,,,--- 夾心法,（1）加入H2O2（pH<10）,,,,（2）加入堿（pH>10）,,直接化學(xué)發(fā)光分析法——原理,2024/3/20,,,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法——原理,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,2024/3/20,,,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法——原理,堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,2024/3/20,,,電化學(xué)發(fā)光免疫分析法

18、——原理,2024/3/20,,優(yōu)點(diǎn)：安全，靈敏度高（10-15g/ml），穩(wěn)定性好，重復(fù)性較佳，結(jié)果漂移小，線性較好，準(zhǔn)確度高，操作方便，試劑貨架期長(zhǎng)（半年~1年），浪費(fèi)少，出結(jié)果快速。 缺點(diǎn)：儀器價(jià)格昂貴，試劑成本較高，目前有些檢測(cè)項(xiàng)目不能用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，待開(kāi)發(fā)。,化學(xué)發(fā)光免疫分析法——特點(diǎn),2024/3/20,,,化學(xué)發(fā)光免疫分析法——應(yīng)用,目前，CLIA已廣泛應(yīng)用于生命分析、環(huán)境檢測(cè)、臨床檢驗(yàn)、食品安全和工業(yè)

19、分析等領(lǐng)域，rhGH興奮劑檢測(cè)試劑盒“CMZ-Assay”就是利用CLIA技術(shù)分別檢測(cè)22kD-hGH和非22kD-hGH的濃度。,2024/3/20,,,世界反興奮劑組織檢測(cè)采用的是由Lasne等于2002年提出的等電聚焦( isoelectric focu-sing，IEF) 結(jié)合免疫雙印跡化學(xué)發(fā)光法。 該方法基于rhEPO與內(nèi)源性EPO等電點(diǎn)的不同從而判斷被檢測(cè)者是否濫用該類藥物。樣品經(jīng)過(guò)有效富集后進(jìn)行等電聚焦，之后將凝膠上

20、的條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上進(jìn)行二次印跡，二次印跡可以有效地阻止第二抗體的非特異性結(jié)合，從而避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，最后在發(fā)光氨和過(guò)氧化氫的作用下進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。該方法的誤檢率僅為0. 006%～0. 03%。后來(lái)，針對(duì)此方法研制了特定的圖像分析軟件 GASepo，可進(jìn)行閾值計(jì)算、條帶分割和算法分類，從而達(dá)到對(duì) EPO 定量的目的。,化學(xué)發(fā)光免疫分析法——應(yīng)用,2024/3/20,參考文獻(xiàn),[1]李衛(wèi)東.興奮劑檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].

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