1、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP）是一種產(chǎn)耗量大、應(yīng)用廣泛、危害性強(qiáng)的鄰苯二甲酸酯類化合物，它已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的環(huán)境持久性有機(jī)污染物。人類可以通過(guò)飲食飲水、空氣塵埃、皮膚吸收和醫(yī)療暴露等多種途徑接觸到DEHP，其中經(jīng)消化道暴露是主要方式，并且兒童表現(xiàn)出對(duì)DEHP更高的易感性。流行病學(xué)調(diào)查資料提示長(zhǎng)期DEHP暴露與現(xiàn)階段支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎等疾病在遺

2、傳背景相對(duì)穩(wěn)定的同一地區(qū)人群尤其是兒童中持續(xù)高發(fā)密切相關(guān)。已知體液免疫失調(diào)是這類 IgE介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病的致病基礎(chǔ)。濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cell, Tfh）是新近確認(rèn)的輔助B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的重要Th細(xì)胞亞群，其分化紊亂和功能異常會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的免疫平衡。Tfh細(xì)胞可以通過(guò)自身表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)受體來(lái)應(yīng)對(duì)外界刺激。細(xì)胞核表面或細(xì)胞漿內(nèi)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome prol

3、iferator-actived receptor-γ, PPAR-γ）能夠與相應(yīng)配體發(fā)生選擇性結(jié)合，繼而進(jìn)入細(xì)胞核對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。已有研究表明 DEHP亦是一種核激素受體調(diào)節(jié)因子，其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可與PPAR-γ識(shí)別結(jié)合并相互作用，由此介導(dǎo)產(chǎn)生全身或局部毒效應(yīng)。鑒于此，我們著眼于Tfh細(xì)胞這個(gè)新的切入點(diǎn)，探討環(huán)境污染物DEHP對(duì)生長(zhǎng)期小鼠體液免疫應(yīng)答的影響及其具體作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)如下：（1）選擇初

4、斷乳BALB/c小鼠作為研究對(duì)象，給予動(dòng)物經(jīng)口灌胃低、中、高劑量的DEHP溶液，同時(shí)經(jīng)足墊皮下注射OVA致敏，建立生長(zhǎng)期小鼠DEHP消化道暴露模型，采用ELISA法檢測(cè)血清中OVA特異性IgE和IgG1類抗體的分泌量，免疫熒光組織化學(xué)法觀察淋巴小結(jié)生發(fā)中心的形成，流式細(xì)胞術(shù)分析外周淋巴器官Tfh細(xì)胞和漿細(xì)胞的分化數(shù)量。（2）依次將DEHP暴露和正常小鼠Tfh細(xì)胞或非Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞進(jìn)行T、B細(xì)胞兩兩混合，經(jīng)尾靜脈注射過(guò)繼性輸入先天性T

5、、B淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能明顯缺陷的SCID小鼠體內(nèi)，OVA致敏后采用ELISA法檢測(cè)血清中OVA特異性IgE和IgG1類抗體的分泌量。隨后，進(jìn)一步分析 DEHP灌胃染毒對(duì)生長(zhǎng)期 BALB/c小鼠外周淋巴器官 Tfh細(xì)胞核受體PPAR-γ表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控與細(xì)胞因子分泌功能的影響，采用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR與Western Blot檢測(cè)Tfh細(xì)胞核受體PPAR-γ、特定核轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)分析Tfh細(xì)胞核轉(zhuǎn)

6、錄因子表達(dá)以及胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-21和IL-4的合成水平。（3）針對(duì)Tfh細(xì)胞建立DEHP體外暴露聯(lián)合干預(yù)模型，分析在阻斷或激動(dòng)PPAR-γ時(shí)，DEHP對(duì)Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、表面分子表達(dá)以及細(xì)胞因子分泌功能的影響，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR與Western Blot檢測(cè)Tfh細(xì)胞特定核轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)分析Tfh細(xì)胞膜表面標(biāo)志物與核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè) Tfh細(xì)胞培養(yǎng)上清液中特征性細(xì)胞

7、因子 IL-21和IL-4的分泌量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）DEHP胃腸道暴露能夠以類似佐劑樣毒性作用促進(jìn) OVA致敏的生長(zhǎng)期小鼠血清中特異性IgE和IgG1類抗體分泌增多，外周淋巴器官生發(fā)中心擴(kuò)增，其內(nèi) CD4+CXCR5+ICOS+/CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞和CD19+CD138+GL-7+漿細(xì)胞分化增加。（2）正常小鼠 Tfh細(xì)胞與 B細(xì)胞混合過(guò)繼輸注重建了基礎(chǔ)水平特異性 IgE和 IgG1類抗體的誘導(dǎo)產(chǎn)生

8、；且 DEHP暴露小鼠Tfh細(xì)胞無(wú)論是與正常小鼠或DEHP暴露小鼠B細(xì)胞混合過(guò)繼性輸入時(shí)，都能促進(jìn)受體小鼠血清中OVA特異性IgE和IgG1分泌升高；而DEHP暴露小鼠B細(xì)胞與正常小鼠Tfh細(xì)胞混合過(guò)繼輸注則不能提高抗體含量。DEHP胃腸道暴露能夠以佐劑樣作用促進(jìn) OVA致敏原誘導(dǎo)生長(zhǎng)期小鼠外周淋巴器官 Tfh細(xì)胞的核受體PPAR-γ以及特定核轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf表達(dá)增加，胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-21和IL-4合成增多。（3）DEH

9、P體外暴露能夠上調(diào)Tfh細(xì)胞相關(guān)分子包括核轉(zhuǎn)錄因子、膜表面標(biāo)志物以及細(xì)胞因子的表達(dá)水平；當(dāng)在DEHP暴露組的培養(yǎng)體系中加入PPAR-γ阻斷劑時(shí)，Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf以及表面分子CXCR5、ICOS和PD-1表達(dá)降低，細(xì)胞因子IL-21和IL-4分泌減少；當(dāng)添加PPAR-γ激動(dòng)劑時(shí)，Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf表達(dá)量以及細(xì)胞因子IL-4分泌量進(jìn)一步升高。
　　綜上所述，我們可以得出以下結(jié)論：（1）DE

10、HP胃腸道暴露能夠以類似佐劑樣毒性作用引起OVA致敏的生長(zhǎng)期小鼠體液免疫應(yīng)答失調(diào)，促進(jìn)生發(fā)中心擴(kuò)增、漿細(xì)胞分化增加以及速發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)抗體產(chǎn)生增多。（2）DEHP對(duì)OVA致敏小鼠體液免疫應(yīng)答的干擾作用直接起因于Tfh細(xì)胞。DEHP胃腸道暴露能以佐劑樣作用促進(jìn)致敏原誘導(dǎo)生長(zhǎng)期小鼠外周淋巴器官中初始Th細(xì)胞向Tfh細(xì)胞分化過(guò)度，Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞因子分泌功能紊亂，其輔助B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答失調(diào)。（3）Tfh細(xì)胞中PPAR-γ可能