1、DNA自動測序核酸分子雜交,RNA抽提純化和逆轉錄-PCR,載體與片段連接、感受態(tài)細胞轉化,細胞培養(yǎng)及細胞轉染,分子生物學實驗培訓總結,質(zhì)粒抽提和酶切鑒定,,,重組DNA鑒定,,目的蛋白的表達及功能的研究,獲得目的基因,,,DNA重組,遺傳的中心法則,1958年Crick提出以DNA為中心的遺傳信息的傳遞規(guī)律，即DNA貯存的遺傳信息通過復制傳給子代DNA，通過轉錄傳給RNA，再通過翻譯傳給蛋白質(zhì)。遺傳信息傳遞方向的這個規(guī)律被稱

2、為～。,DNA,,RNA,,,,蛋白質(zhì),復制,復制,轉錄,翻譯,,反轉錄,1970年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)RNA病毒的RNA可通過反轉錄（逆轉錄）將遺傳信息傳給cDNA，也可通過RNA復制或RNA轉錄傳給子代RNA，這是對中心法則的補充。1997年瘋牛病和朊病毒的出現(xiàn)，預示蛋白質(zhì)也可逆向?qū)⑦z傳信息向DNA傳遞。,,？,DNA的結構及功能,DNA分子是由兩條反向平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交

3、替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排在內(nèi)側。兩條鏈的堿基通過氫鍵連接形成堿基對，其中A與T配對，G與C配對。兩個相鄰脫氧核苷酸通過3’ -5’磷酸二酯鍵連接。起著貯存和傳遞遺傳信息的作用。,RNA的種類Category,轉運核糖核酸(transfer RNA, tRNA) 核蛋白體核糖核酸(ribosome RNA, rRNA)信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA),轉運氨基酸與蛋白質(zhì)結合形成核蛋白體,

4、起裝配機的作用翻譯蛋白質(zhì)的模板,RNA的功能Function,mRNA的生物合成mRNA Biosynthesis,真核生物的結構基因由內(nèi)含子和外顯子組成，內(nèi)含子的序列較長，且不編碼蛋白質(zhì)。真核生物DNA在轉錄過程中經(jīng)剪接可將內(nèi)含子部分去除，獲得成熟的mRNA。由于分子生物學研究的最終產(chǎn)物常常是蛋白質(zhì)，因此我們需要獲得可翻譯的mRNA。mRNA易降解，不易長期保存。將mRNA逆轉錄成cDNA，利用cDNA來研究基因的功能。

5、,Trizol提取RNA原理,Trizol法提取細胞總RNA是目前常用的提取方法。細胞內(nèi)大部分的RNA與蛋白質(zhì)結合在一起，以核蛋白形式存在。 Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍和苯酚等物質(zhì)。異硫氫酸胍(GuSCN)是一種強的蛋白質(zhì)變性劑，不僅能使細胞裂解，同時還能有效地抑制細胞內(nèi)源性RNA酶的活性。通過有機溶劑的分步抽提，最終可獲得純度較高的細胞總RNA。,RNA提取注意事項,Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮膚

6、接觸Trizol，請立即用大量水沖洗。 RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意隨時勤換手套，樣品盡可能蓋嚴；盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話。用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。在清洗和裂解細胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。,逆轉錄(Rever

7、se Transcription),逆轉錄指遺傳信息從RNA流向DNA，是RNA指導下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補的DNA單鏈，稱為互補DNA ( complementary DNA, cDNA),逆轉錄原理,cDNA合成有兩個關鍵因素，一是病毒RNA的質(zhì)量，二是逆轉錄酶。逆轉錄酶是一種多功能酶，它能在一定的條件下，以單鏈RNA為模板合成第一條cDNA鏈。通過RNaseH活性水解R

8、NA-DNA雜合分子中的RNA鏈。,逆轉錄酶(reverse transcriptase),催化逆轉錄過程的酶稱逆轉錄酶，RNA病毒中都含有此酶。 具有三種酶活性： RNA指導的DNA聚合酶 RNA水解酶活性 DNA指導的DNA聚合酶,,逆轉錄體系,RNA模板—— 3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA 5’,引物—— 5’ATCCGGAC,,逆轉錄酶,dATP,dGTP,dCTP,dTT

9、P,,Mn2+,,,酶活性依賴金屬離子,,,,,,底物,逆轉錄過程中cDNA的合成,逆轉錄引物的選擇(Primer),Oligo(dT)(12-18個核苷酸組成），只有mRNA被逆轉錄隨機六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆轉錄基因特異性引物，僅產(chǎn)生需要的DNA,逆轉錄的生物學意義,擴充了中心法則有助于對病毒致癌機制的了解與真核細胞分裂和胚胎發(fā)育有關逆轉錄酶是分子生物學重要工具酶,以DNA為模板，利用DNA聚合酶的特性體外擴增特定的

10、基因片斷，這種方法被稱為DNA聚合酶鏈式反應。,,,,PCR 基因放大連瑣反應,聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR),PCR基本原理,利用高溫可使DNA變性和低溫可使DNA復性的特性，根據(jù)體內(nèi)細胞分裂中DNA半保留復制機理，以特異性寡核苷酸為引物， DNA分子為模板，在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸存在的條件下體外合成新DNA分子的過程。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在

11、合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復。,PCR技術的特點,高度的敏感性高度的特異性操作簡便、快速適用樣品的廣泛性,PCR基本成分,templateprimersTaq polymerase10×PCR bufferdNTPsMg++,PCR Primers,www.ncbi.nlm.nih.gov,PCR Primers,序列發(fā)現(xiàn)的時間和發(fā)現(xiàn)者序列的生物體來源序列的組織來源,引物設計(Primer design)

12、,引物長度（length）: 20～30bp引物中四種堿基的分布應該是隨機的兩引物間不能有互補序列，尤其是3‘端引物的堿基順序不應與非擴增區(qū)域由同源性引物的3’末端堿基一定要與模板DNA配對可以在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點或起始密碼解鏈溫度(Tm)：兩引物間相差不大于5℃引物內(nèi)部不能有大于3bp的反向重復序列或自身互補序列存在,PCR基本程序,預變性（Pre-denaturation)變性(Denaturation)

13、退火(Annealing)延伸(Elongation)25-30 cycles,Double stranded DNA template,Double stranded DNA template,,,Design primers with this sequence information,PCR CYCLE 1,Double stranded DNA template,,,Primers,Taq,Taq,PCR CYC

14、LE 1,Denaturation950Cstrands separate,,,Primers,Taq,Taq,Taq polymerase is thermostable,,,,,3’,5’,5’,3’,PCR CYCLE 1,Annealing~550CPrimers bind,Taq,Taq,,,,,3’,5’,5’,3’,PCR CYCLE 1,Annealing~550CTaq binds to duplex

15、,Taq,Taq,,,,3’,5’,5’,3’,,,PCR CYCLE 1,Extension72oCTaq copies DNA stranddNTPS,Taq,Taq,Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction,,,,3’,5’,5’,3’,,,,PCR CYCLE 1,Extension72oCTaq copies DNA strand,Taq,Taq,Taq sy

16、nthesises DNA in the 5’ to 3’ direction,,,,3’,5’,5’,3’,,,,,,PCR CYCLE 1,Extension72oCTaq copies DNA strand,Taq,Taq,Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction,,,3’,5’,5’,3’,5’,3’,,5’,3’,PCR CYCLE 1,End cycle 1,,PC

17、R animation,PCR反應,取無菌0?2ml PCR管一支，加入：10?PCR緩沖液 5μl氯化鎂 4μl4種ｄNTP混合液(10mmol/L) 0?5μl3?端引物(10μmol/L) 1μl5?端引物(10μmol/L) 1μlTaq DN

18、A多聚酶(5u/μl) 0?25μl三蒸水 33?25μl模板cDNA 5μl蓋緊蓋子，離心數(shù)秒后置PCR儀上進行擴增。PCR循環(huán)為：95℃預變性2 min，95℃變性30 s、55℃復性30 s、72℃延伸1 min， 30個循環(huán)，最后72?C延伸7 min。,細胞裂解,RNA釋

19、放,cDNA,PCR擴增,逆轉錄酶,耐熱DNA聚合酶,,RT-PCR擴增,,,,,,,,,,,,,,,,,引物dNTPs二價金屬離子DNA聚合酶,引物dNTPs二價金屬離子逆轉錄酶,RT-PCR過程,逆轉錄酶/耐熱DNA聚合酶,RT-PCR的應用(application),獲得基因完整編碼區(qū)序列檢測基因轉錄產(chǎn)物半定量比較不同樣品間mRNA水平制備用于雜交的cDNA探針,PCR技術在臨床應用中的問題和對策,在我國，前一

20、個時期PCR應用相當混亂。從技術因素分析，常規(guī)PCR作為臨床檢驗技術存在的最主要的問題是，擴增產(chǎn)物污染帶來的假陽性。常規(guī)PCR只能定性不能定量，也影響了評價PCR檢測結果的臨床診斷意義。定量是PCR作為臨床檢驗技術發(fā)展的另一個重要目標。,瓊脂糖凝膠電泳基本原理,瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖作為固體支持物的一種電泳方法。因為各種核酸分子的電荷及質(zhì)量之比是相近的，在沒有支持物的電場中，它們以相同的速度前進。瓊脂糖凝膠電泳具有分子篩效應

21、，所以在適當濃度的瓊脂糖凝膠中電泳，線性DNA分子在電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)成反比，從而達到分離的目的。,瓊脂糖凝膠電泳（Agarose Gel Electrophoresis）分離的原理,使 TAE浸過凝膠表面在陰極的加樣孔加樣（紅正黑負）分子篩作用分子量越小，遷移速度越快,瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍Separation Range Vs. % Agarose,瓊脂糖凝膠濃度與分離效率,,,大片段在 0.7%瓊脂

22、糖凝膠中分離效果好,小片段在 1.5%瓊脂糖凝膠中分離效果好,上樣,上樣緩沖液甘油可增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便EDTA, SDS 可滅活限制性內(nèi)切酶,溴化乙錠( EB)染色,EB堆砌在DNA雙螺旋的堿基對之間,DNA 分子越小,結合的EB 越少,染色越淡,溴化乙錠是一種熒光染料,可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激

23、發(fā)下，發(fā)出紅色熒光，常用 0.5mg/ml,+,+,,注意事項,一定要等凝膠冷卻至60℃時再入加溴化乙錠切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣 孔的一端為負) 加完樣品后最好先觀察一段時間插電極或拔電極時必須將儀器電源關掉不要使樣品跑出凝膠,瓊脂糖凝膠電泳應用,PCR產(chǎn)物鑒定酶切片段鑒定DNA片段回收DNA的定量,分子克隆(molecular cloning)基因工程的核心,克?。嚎寺∈侵竿ㄟ^無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親

24、 代完全相同的子代群體,分子克隆,細胞克隆,動物克隆,基因工程中所指的克隆，是在體外對DNA分子按照既定目的和方案進行人工重組，將重組分子導入合適細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA分子得大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作的，故稱為分子克隆。又被稱為基因克隆或DNA克隆。,分子克隆中常用的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶末端轉移酶逆轉錄酶堿性磷酸酶核酸外切酶,基因克隆的基本程序,外源基因或

25、目的基因的獲得載體的構建或選擇連接轉化陽性重組體的篩選與鑒定,目的基因,目的基因是指我們所要研究和應用的基因，也就是我們將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中的第一步。體外擴增基因法(PCR and RT-PCR) 人工合成基因法限制性內(nèi)切酶直接分離法獲得基因文庫篩選法從cDNA文庫中篩選,RT-PCR,RNA 提取RT-PCR,Extract RNA from virus/cells,RNA,載

26、體(Vector),載體是指能夠攜帶外源基因轉入受體細胞內(nèi)進行擴增或誘導外源基因在受體細胞內(nèi)表達的工具。,載體應具備的條件,帶有復制子多克隆酶切位點篩選標志完整的轉錄單位（表達型載體）,載體的分類,按功能分類：克隆載體和表達載體按受體細胞分類：原核細胞載體和真核細胞載體按載體來源分類：質(zhì)粒載體、嗜菌體、病毒、酵母人工染色體、粘粒,pGEM-T Easy Vector,綠色熒光蛋白載體,酶切載體和目的基因(Enzyme rest

27、riction digest of DNA plasmid vector and target gene）,目的基因與載體的連接（ligation）,利用DNA連接酶把載體DNA和要克隆的目的DNA片段連接在一起，成為一個完整的重組分子，被稱為連接反應。,DNA 連接酶(DNA Ligase),催化兩個獨立的DNA片段5‘-磷酸基團和3’-羥基基團之間形成磷酸二酯鍵。,連接方法,粘性末端連接法：單酶連、雙酶連平齊末端連接法同聚物接尾

28、法人工接頭法PCR產(chǎn)物與載體的連接：限制性酶切位點添加法、T/A克隆法,單一酶切的粘性末端連接缺點,載體自連：載體DNA兩端的粘性末端可以自身退火成環(huán)，產(chǎn)生載體-載體相連接的假陽性克隆。雙向插入：由于使用同一種內(nèi)切酶，載體與插入片段的4個末端全為相同的粘性互補順序，所以目的基因插入可以有兩個方向。,,,Bam HⅠ切割反應,T4 DNA連接酶 15ºC,,,同一限制酶切位點連接,不同限制酶切位點的連接（雙酶連）,Eco

29、 RⅠ切割位點,Bg lⅡ切割位點,平端連接,適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補齊或切平形成的平端,同聚物加尾連接,在末端轉移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。,人工接頭(linker)連接,在平端加上酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。,T/A克隆法,利用含有單個胸腺嘧啶（T）3‘-突出末端的線性化載體

30、與帶有單個腺苷酸（A）3‘-突出末端的PCR產(chǎn)物來進行克隆，這種方法被稱為T/A克隆法。此方法利用了Taq DNA聚合酶具有延伸酶的活性，即不依賴模板的方式將一個核苷酸添加到已完成延伸的PCR產(chǎn)物的3‘-末端。在四種核苷酸都存在的情況下，這個添加上去的核苷酸通常是A殘基。,重組分子導入受體細胞,外源DNA分子與載體組成重組分子后，需要導入受體細胞才能進行繁殖和表達，受體細胞系指被導入重組分子的細胞，又稱宿主細胞。根據(jù)導入受體細胞的方式

31、不同，可分為：轉化（transformation）：將重組DNA分子導入原核細胞的過程轉染（transfection）：將重組DNA分子導入真核細胞的過程感染（infection）：噬菌體進入宿主細菌，病毒進入宿主細胞中繁殖的過程,轉化過程,制備感受態(tài)細胞（competent cell）：用物理或化學方法處理細胞，使其處于最適攝取和容忍外來DNA的生理狀態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。將重組DNA分子和感受態(tài)細胞相混合，使DNA分子

32、進入大腸桿菌細胞中。轉化細胞在含有抗生素的瓊脂平板上生長,氯化鈣法原理,細菌處于0℃氯化鈣低滲溶液中，細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基鳥磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42 ℃短時間熱休克處理，促進細胞吸收DNA復合物。在培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。被轉化的細菌中，重組基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可篩選出所需的轉化子。,氯化鈣法(Chemical transformation with

33、 Calcium Chloride ),CaCl2方法的轉化效率一般可達106-107轉化子/μg DNA。關鍵是(1)使用對數(shù)生長期的細菌 (2)低溫操作 (3)手法溫柔優(yōu)點: 簡單、穩(wěn)定、可重復性高。缺點: 轉化效率稍低，而且不能轉化大質(zhì)粒(＞15Kb),電轉法(Transformation by Electroporation),重組DNA的篩選與鑒定,抗藥性篩選法藍白篩選法DNA限制性內(nèi)切酶圖譜

34、分析DNA序列測定法核酸雜交法PCR法,抗生素篩選轉化結果,Growth on agar plates (Amp+X-Gal) and selection for antibiotic resistant colonies,,重組DNA技術操作過程可形象歸納為,小 結,重組DNA技術操作的主要步驟,克隆常見問題,轉化后無克隆產(chǎn)生白色菌落很少或者根本沒有實驗組只有白色菌落白色菌落中陽性克隆率低,重組DNA的應用,克隆基因

35、的表達探針標記基因組序列分析基因的定點突變基因打靶技術轉基因技術,質(zhì)粒提取及酶切鑒定,實驗目的及背景,質(zhì)粒是獨立于細菌染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復制和遺傳獨立于細菌染色體，但復制和轉錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。,plasmid,chromosome,質(zhì)粒類型,質(zhì)粒按復制方式分為兩種類型： 松弛型

36、質(zhì)粒和 嚴緊型質(zhì)粒1.松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid) 松弛型質(zhì)粒的復制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復制依然進行。2.嚴緊型質(zhì)粒(stringent plasmid) 嚴緊型質(zhì)粒復制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。按功能分為3類：F質(zhì)粒（即性質(zhì)粒） R質(zhì)粒（即抗藥性質(zhì)粒） C

37、ol質(zhì)粒（即大腸桿菌素因子）,質(zhì)粒DNA的一般性質(zhì),環(huán)狀超螺旋DNA分子質(zhì)?？梢赞D移質(zhì)粒的復制依賴宿主細胞的復制機器質(zhì)粒有相容性及不相容性質(zhì)粒能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。,Target Genes Carried by Plasmid,1 plasmid1 cell,Recombinant PlasmidTransformation,Target GeneRecombinatio

38、n,RestrictionEnzyme,RestrictionEnzyme,Chromosomal DNA,Target Genes,DNA Recombination,Transformation,Host Cells,,,Juang RH (2004) BCbasics,質(zhì)粒的應用,大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴緊型質(zhì)粒用來表達一些可使宿主細胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要

39、媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值。,質(zhì)粒載體(plasmid vectors),是一獨立的復制子有篩選標記具有酶切位點或多克隆位點分子量小，拷貝數(shù)高測序、亞克隆、表達、可重復性高,分離質(zhì)粒DNA方法,從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的有：堿變性法； 煮沸法； SDS法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結構等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收

40、得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉化。,質(zhì)粒DNA提取的步驟,所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；DNA分離質(zhì)粒DNA；,培養(yǎng)單克隆細胞,Amplification and Screening of Target Gene,,,,,1,1 cell line, 1 colony,X100,X1,000,PlasmidDuplication,Bacteria Duplica

41、tion,Plating,Pick the colonycontaining target gene,,=100,000,,Juang RH (2004) BCbasics,堿變性法基本原理,在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)

42、粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。,質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策,質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這是由于：從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA 。DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應。重新沉淀

43、DNA，讓酒精充分揮發(fā)。DNA中殘留有金屬離子，可增加70%乙醇洗滌的次數(shù)。出現(xiàn)無質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象，這可能是由于細菌中無質(zhì)粒或核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去,重組質(zhì)粒的鑒定,瓊脂糖凝膠電泳限制性內(nèi)切酶酶切紫外分光光度計測定DNA自動測序核酸雜交法PCR法,質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳(Agarose Gel Electrophoresis),在一定電場強度下，DNA分子的遷移取決于DNA分子本身的大小和構型。相對分子質(zhì)量不同的

44、DNA片段泳動速度不一樣。質(zhì)粒DNA的形態(tài)不一，電泳時在凝膠中的遷移率不同。因此，凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構型不同的DNA分子。超螺旋的質(zhì)粒DNA一般遷移最快、開環(huán)（缺口）質(zhì)粒DNA遷移最慢，線化DNA位于兩者之間。,質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳,限制性核酸內(nèi)切酶,1970年發(fā)現(xiàn)的，是一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定堿基順序的核酸水解酶。被稱為分子生物學的“手術刀”。有三種類型的限制性

45、內(nèi)切酶，最常用的是Ⅱ型識別順序一般為4-6個堿基的回文結構。如下：,Palindrome, Restriction Enzyme, Sticky Ends,,,Sticky Ends(Cohesive Ends),,EcoRI,,Juang RH (2004) BCbasics,限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口,平頭末端(blunt end)5’端突出的粘性末端3’端突出的粘性末端,平頭末端(blunt end),在

46、識別順序的對稱軸上，對雙鏈DNA同時切割，產(chǎn)生平頭末端(blunt end) 5’-GG CC-3’ HaeⅢ 5’-GG CC-3’ 3’-CC GG-5’ 3’-CC GG-5’,,,,5’端突出的粘性末端,在識別順序的兩個對稱點切開DNA雙鏈，產(chǎn)生帶單鏈尾巴的粘性末端,從5’端切割產(chǎn)生5’端突出的粘性末端5’-G AATTC-3’

47、 EcoRⅠ5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’,,,,3’端突出的粘性末端,在識別順序的兩個對稱點切開DNA雙鏈，產(chǎn)生帶單鏈尾巴的粘性末端,從3’端切割產(chǎn)生3’端突出的粘性末端 5’-CTGCA G-3’ PstⅠ 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGT

48、C-5’ 3’-G ACGTC-5’,,,,用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒,質(zhì)粒 4ul去離子水 4ul10xbuffer 1ulEcoRⅠ 0.5ul離心混合后，37℃ 1小時,酶切反應注意事項,決不能用水稀釋,以免變性失活。預先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避

49、免反復凍融。使用無菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會抑制酶活性。,限制性核酸內(nèi)切酶的應用,改造及組建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與順序分析,測序技術進展同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳,多色熒光標記毛細管電泳,單色熒光標記平板電泳,同位素標記平板電泳,,A,C,G,T,,,,,,測序圖譜,T A T

50、TG CAT TG TC TGCATTG T C T,,,,Dideoxynucleotides,,Phosphodiesterbond,3’,5’,dideoxynuceotide,Terminated,ddNTP,Sanger’s Method: How Terminated,Normal Linking,Can not react,,Juang RH (2004) BCbasics,The ddATP Reaction,5’TT

51、ATCG,3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’,5’TTATCGTA,5’TTATCGTACCATGA,5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA,5’TTATCGTACCATGACTAGA,DNA自動測序,DNA自動測序是在Sanger法的基礎上經(jīng)過加工改進的。將2‘,3’-雙脫氧三磷酸核苷酸(ddNTP)用不同的熒光標記，如用紅色熒光標記ddTTP，藍色熒光標記ddCTP，黃色熒光標記ddG

52、TP，綠色熒光標記ddATP。在測序PCR反應中，將熒光標記的ddNTP摻入到反應中，當某一ddNTP分子摻入到合成的DNA分子中時，該鏈延伸終止并且標記上相應的熒光染料分子。反應終止后，就會得到不同熒光標記的長短不同的DNA分子。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電泳分離后，用熒光檢測儀檢測，收集的信號經(jīng)過計算機分析后便可以得到DNA的核苷酸序列。,測序反應 (20μl),模板(template)：200-500ng引物(prime

53、r)：5pmolPremix(ddNTP, dNTP, Taq Polymerase): 8μlH2O95℃20 s, 50℃15 s, 60℃ 1min, 25 cycles,原始數(shù)據(jù)分析,除文本文件外，DNA自動測序還提供測序圖數(shù)據(jù)讀取軟件可以對原始數(shù)據(jù)進行處理，得到最終的測序結果,,,測序結果分析,影響測序結果的因素,DNA自動測序在醫(yī)學上的應用,基因組研究疾病診斷基因分型,分子生物學中使用的雜交方法,核酸分子雜交原理

54、,核酸分子雜交技術是分子生物學領域中最常用的基本技術之一,其基本原理就是應用核酸鏈中堿基互補的原理（A-T，C-G），用已知的核酸（探針），通過雜交來檢測樣本中與探針同源的核酸序列。根據(jù)雜交對象的不同可以分為DNA（模板）/DNA或RNA（探針）的雜交即Southern blotting ；RNA（模板）/DNA或RNA（探針）雜交即Northern blotting。,核酸分子雜交的必要條件,固相載體（液相雜交除外），常用的有硝酸纖

55、維素膜、尼龍膜、玻片、聚苯乙烯等。帶示蹤物標記的探針，常用的有放射性同位素、地高辛（Digoxigenin-11-dUTP)、生物素（Biotin）等。經(jīng)變性處理的待檢模板。合適的雜交條件。示蹤物檢測系統(tǒng)。,探針標記,缺口移位法（缺口平移、缺口翻譯）末端標記法PCR摻入法,探針和模板的單鏈化,加熱變性堿變性,標記示蹤物的檢測,放射性同位素的檢測：感光膠片地高辛檢測：(Anti-Dig)Antibody-AP，底物為BCI

56、P+NBT生物素檢測：Biotin-Streptavidin-AP,BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽NBT；氯化四唑硝基藍（氯化四唑氮藍）,標本,源于病人：血清/血漿等源于細胞：基因組源于培養(yǎng)物：細菌、病毒等重組質(zhì)粒核酸擴增產(chǎn)物其它,Southern / Northern Blotting (Hybridization),,,,Removeunboundprobe,intact RNA or digested

57、 DNA,Hybridization,探針模板雜交,地高辛標記法原理,將地高辛連接于dUTP第五位的嘌呤環(huán)上，形成Dig- dUTP。DNA通過地高辛配基標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（ dUTP）隨機插入結合而被標記。雜交的靶DNA通過酶聯(lián)免疫法與一個抗體復合物結合，接著在BCIP/NBT存在下，由酶催化反應，在雜交部位顯色。,DIG標記探針的Southern blotting過程示意圖,雜交探針的標記：地高辛系統(tǒng)標記

58、 digoxigenin DIG dUTP-連接臂-甾醇半抗原 抗體-顯色酶交聯(lián)復合物,斑點雜交試驗,bDNA技術,,,,Sample DNA,Each spot contains known DNA,Biochip,Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31,Com

59、plementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,Juang RH (2004) BCbasics,Southern blot 應用,克隆基因的酶切圖譜分析基因組基因的定性及定量分析基因突變分析限制性片段長度多態(tài)性分析,細胞轉染,轉染技術是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術，它是研究基因表達調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具，隨著功能

60、研究的興起，其應用越來越廣泛。,傳統(tǒng)方法,轉染技術Transfection,,細胞轉染分類,瞬時性轉染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。穩(wěn)定轉染：DNA整合到宿主細胞的染色體中或形成附加體。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記反復篩選，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。,細胞

61、轉染(Transfection)及報告基因表達的檢測原理,目的基因轉染細胞后，對目的蛋白的表達及功能的研究可通過檢測特定報告基因的表達實現(xiàn)。常用的基因報告系統(tǒng)有熒光蛋白報告系統(tǒng)、半乳糖苷酶報告系統(tǒng)、熒光素酶報告系統(tǒng)。綠色熒光蛋白(GFP)在藍光或紫外光激發(fā)下可發(fā)射綠色熒光的特性使得我們在轉染細胞后，無需對細胞作特殊的處理，只需觀察細胞內(nèi)綠色熒光的產(chǎn)生情況，就可了解轉染效率。,轉染細胞的鑒定,熒光顯微鏡觀察GFP（green fluo

62、rescent protein),存在于水母和珊瑚等腔腸動物內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，當受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP發(fā)射綠色熒光將綠色熒光蛋白表達的質(zhì)粒轉入不同類型的細胞瞬時轉染，可以比較不同細胞間轉染效率的差異，記錄表達綠色熒光蛋白細胞數(shù)的百分比，評價轉染效率。Western-blot 鑒定RT-PCRSouthern-blot 鑒定,在熒光顯微鏡下觀察轉染結果,影響轉染效率的主要因素,細胞培養(yǎng)物血清載體構建DNA質(zhì)量轉染技術

63、,細胞培養(yǎng)物,健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉染的基礎。不同細胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。高的轉染效率需要一定的細胞密度，一般推薦在轉染前24小時將細胞傳代，這樣可提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能。另外一定要避免細菌、支原體或真菌的污染。,血清,大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。通常血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉染效率。因此在轉染前建議先

64、測試出對細胞生長良好的血清批號，轉染時用同一批號的血清，并同時做負對照（不加轉染試劑及外源DNA）以測試細胞生長是否正常。有些轉染技術如脂質(zhì)體轉染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉染前要除血清。但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷，甚至死亡導致轉染效率極低。,載體構建,轉染載體的構建（病毒載體，質(zhì)粒DNA、RNA、PCR產(chǎn)物、寡核苷酸等）也影響轉染結果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要

65、求特定的細胞周期，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構建外，載體的形態(tài)及大小對轉染效率也有不同的影響，超螺旋質(zhì)粒DNA效率最高，線性DNA導入效率不如超螺旋DNA，但整合到染色體效率較高。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成及合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因相同載體構建的正對照可排除毒性影響的干擾。,DNA質(zhì)量,DNA質(zhì)量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原