1、1實驗四：免疫共沉淀實驗四：免疫共沉淀—蛋白質(zhì)免疫印跡分析蛋白質(zhì)免疫印跡分析姓名：學號：專業(yè)：【實驗目的】1、掌握蛋白質(zhì)免疫印跡分析的基本原理2、掌握蛋白質(zhì)免疫印跡分析的基本操作過程【實驗原理】蛋白質(zhì)免疫印跡分析又稱WesternBlot，是以某種抗體作為探針，使之與附著在固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原部位發(fā)生特異性反應，從而對復雜混合物中的某些特定蛋白質(zhì)進行鑒別和定量。這一技術講蛋白質(zhì)凝膠電泳分辨率高與固相免疫測定特異性強的特點結合

2、起來，是一種重要的蛋白質(zhì)分析測試手段。蛋白質(zhì)凝膠電泳利用不連續(xù)系統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的分辨率。由于其電泳體系中有三種物理效應：（1）凝膠的分子篩效應；（2）電泳分離的電荷效應（3）樣品的濃縮效應。固相免疫測定是通過電場作用把凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，封閉非特異位點后，使用目的蛋白的特異抗體檢測，并通過種屬特異的二級抗體的結合及放射自顯影或者原位酶反應，確定抗原抗體抗抗體復合物的位置及豐度。本實驗是蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗的

3、第二部分，主要是通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析對大鼠肝組織中PCNA與p21相互作用進行檢測。同時，進一步學習蛋白質(zhì)免疫印跡分析原理及基本操作過程。【實驗流程】1、配制TrisSDSPAGE：a洗板及電泳裝置，并確定其底端的密閉性；b配置10%分離膠，灌膠至距梳齒下緣0.5～1cm，加水封閉，聚合約30min；c去水，并配置5%濃縮膠，插入梳子，注意避免氣泡，室溫約30min；d裝好電泳裝置，內(nèi)槽倒?jié)M電泳緩沖液，拔去梳子，并沖洗加樣孔。2、準備

4、樣品：加入工作液為1的loadingbuffer，煮沸5min，瞬離，上樣。3、電泳：80V，30min；100V1h。4、轉膜：濕轉方式，安放順序：黑膠（SDSPAGE）白膜（NC膜），由陽極向陰極依次安放：3層濾紙3張，NC膜，凝膠，3層濾紙；注意除氣；電轉100V，1h；5、封閉：5%脫脂奶粉封閉NC膜，室溫，1h；6、一抗孵育：NC膜放入雜交袋，封好三面，加入一抗（1：2000稀釋的小鼠抗大鼠PCNA抗體），封嚴雜交袋，4℃ov

5、ernight。3來不確定性。4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實驗結果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。5、電泳、轉膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉溫度保持在10度以下，冰浴為宜。6、加一抗二抗要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低