1、聚羥基脂肪酸酯(PHA)是微生物體內(nèi)合成的一類(lèi)生物聚酯，PHA不僅具有與傳統(tǒng)化學(xué)合成高分子相似的材料性質(zhì)，而且還具有一般傳統(tǒng)塑料沒(méi)有的性質(zhì)，如生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性等特殊性質(zhì)。因此，PHA的應(yīng)用范圍非常廣，可用作工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品業(yè)中各種綠色包裝材料的原材料。由于PHA可以通過(guò)很多可再生資源獲得，因此具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。除了大批量生產(chǎn)PHA用于包裝材料之外，PHA還是一種具有特殊應(yīng)用的極好的醫(yī)學(xué)材料，由于PHA能

2、夠與哺乳動(dòng)物的組織相容，并且緩慢降解；另外，PHA具有一定的力學(xué)性能，可用作骨移植的支架。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者注重于研究PHA在醫(yī)藥及組織工程等方面的應(yīng)用。在全球環(huán)境面臨白色污染威脅、人類(lèi)健康面臨嚴(yán)重器官和組織的障礙及喪失的今天，更應(yīng)該大力發(fā)展PHA產(chǎn)業(yè)，開(kāi)發(fā)更好性能的PHA以適應(yīng)各種特殊應(yīng)用。
　　 對(duì)于PHA的研究已經(jīng)有七十多年的歷史了，從最初聚-3-羥基丁酸酯(PHB)天然顆粒的提取，到聚羥基丁酸羥基戊酸酯(PHBV)的

3、工業(yè)化生產(chǎn)，再到PHA的新單體、新基因、新菌種，不同的發(fā)酵底物、合成途徑以及代謝調(diào)控等等的新發(fā)現(xiàn)，加上蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的相輔相成，人們對(duì)PHA的研究越來(lái)越廣、也越來(lái)越深入，可開(kāi)發(fā)的資源就越來(lái)越少。因此，怎樣從一個(gè)新的視角入手研究PHA的新功能是本論文的目的之一。
　　 在利用大腸桿菌基因工程菌高產(chǎn)PHB時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在積累大量的PHB(達(dá)細(xì)胞干重的90％)后，不單沒(méi)有影響到細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，而且仍然可以生產(chǎn)琥珀酸等一些有

4、機(jī)酸類(lèi)，因此我們致力于發(fā)現(xiàn)和找到PHB對(duì)重組大腸桿菌的“貢獻(xiàn)”以及它的機(jī)制。
　　 PHA是細(xì)菌在生長(zhǎng)條件不平衡時(shí)的產(chǎn)物(比如碳源過(guò)剩，氮源缺乏時(shí))，在環(huán)境不利時(shí)消耗掉以躲過(guò)惡劣環(huán)境的傷害，提高菌體對(duì)外界的適應(yīng)能力。本論文首次在大腸桿菌中研究了PHB合成和降解對(duì)于宿主菌的有利作用。模仿PHB自然合成菌，成功地構(gòu)建了一種壓力誘導(dǎo)的啟動(dòng)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)PHB合成和降解酶基因，無(wú)需進(jìn)行人工誘導(dǎo)，只是在在壓力情況下誘導(dǎo)PHB的合成和降解，就如

5、同自然合成菌一樣；順利的表達(dá)了PHB合成及降解酶基因，得到了一株高產(chǎn)PHB以及3-羥基丁酸的工程菌。同時(shí)還驗(yàn)證了大腸桿菌利用3-羥基丁酸途徑的存在，我們對(duì)大腸桿菌中3HB-CoA合成酶的活性進(jìn)行了體外檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在ATP以及CoA存在時(shí)，即能夠?qū)?-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為CoA形式而進(jìn)入能量代謝循環(huán)，從而為細(xì)胞提供能量。
　　 菌體不僅在碳源豐富時(shí)積累PHB，在氮源缺乏的環(huán)境中，這種不理想的條件非常有益于PHB的產(chǎn)生和積累。氮源的利用率是

6、一個(gè)限制性因素，為了研究氮源限制也能夠在重組菌E.coli DH5α(pSCP-CAB/pQWQ2)中誘導(dǎo)PHB產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)以M9為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含2％的葡萄糖)，而變化NH4C1的濃度(0.2g/L，1g/L，2.5g/L，5g/L)，在這四種培養(yǎng)條件下觀察PHB的誘導(dǎo)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：低濃度氮源會(huì)誘導(dǎo)重組菌更快的更多的積累PHB。
　　 同時(shí)，重組菌對(duì)外界壓力的適應(yīng)能力是通過(guò)饑餓實(shí)驗(yàn)和抗性試驗(yàn)檢驗(yàn)的：積累PHB的工程菌E.c

7、oli DH5α(pSCP-CAB/pQWQ2)在經(jīng)過(guò)32天的饑餓條件下，仍然可以存活和繁殖，這是普通大腸桿菌所不具有的，實(shí)驗(yàn)證明普通大腸桿菌在饑餓培養(yǎng)32天之后，存活率不到1％；同時(shí)探究了PHB合成和降解的這種循環(huán)機(jī)制對(duì)大腸桿菌抗性的影響，分別對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了熱擊、紫外照射、酸、高滲溶液的處理，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)并能降解PHB的菌株E.coli DH5α(pSCP-CAB/pQWQ2)均具有較高的存活率，說(shuō)明重組菌獲得PHB生產(chǎn)能力后，菌體的各種

8、抗性指標(biāo)(如：耐饑餓存活率，抗氧化，抗熱，抗輻射能力以及抗酸能力)均有較大提高，為工業(yè)上利用大腸桿菌生產(chǎn)各種物質(zhì)，提供一個(gè)穩(wěn)定抗逆菌株打下良好基礎(chǔ)。
　　 PHA家族是一個(gè)非常龐大的家族，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PHA至少有150種不同的單體結(jié)構(gòu)，并且還在不斷地發(fā)掘出新的單體。在PHA家族中，單純的PHB或PHA都由于其性能的缺陷影響了它的應(yīng)用范圍。因此開(kāi)發(fā)具有高性能的PHA-co-PHB共聚物是國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。PHA聚合酶是生產(chǎn)共聚物的

9、關(guān)鍵。
　　 本研究以改變PHA聚合酶的底物特異性入手，通過(guò)對(duì)PHA聚合酶分子的改造，使其能夠聚合本來(lái)不能利用的前體物，成為一種具備廣泛底物特異性的酶，從而也就增加了PHA單體的種類(lèi)。我們的目的是構(gòu)建一個(gè)既有SCL-PHA合成能力又有mcl-PHA合成能力的PHA合酶，那么這個(gè)酶應(yīng)該同時(shí)具有Ⅰ類(lèi)合酶和Ⅱ類(lèi)合酶的性質(zhì)。本論文首次引入了遞增截短法來(lái)構(gòu)建一個(gè)具有廣泛底物特異性的PHA合酶的雜合酶。它的優(yōu)點(diǎn)是避免了在構(gòu)建雜合酶時(shí)融合位點(diǎn)

10、難于把握的問(wèn)題，并且通過(guò)文庫(kù)篩選可以得到更多有活性的廣底物特異性的酶。
　　 將Ⅰ類(lèi)PHB合酶和Ⅱ類(lèi)的mcl-PHA合酶同時(shí)克隆于一個(gè)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli LS5218△fadA進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，結(jié)果表明重組菌能夠生產(chǎn)PHB/mcl-PHA的共混物，而且驚喜的發(fā)現(xiàn)PHB含量在85～95％。為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)良性能的PHB/PHA共混物提供了良好的開(kāi)端。然后，對(duì)PHA合酶進(jìn)行的分子進(jìn)化改造，我們通過(guò)遞增截短文庫(kù)法將合成m

11、cl-PHA的合酶基因phaC1基因從3'端向5'端酶切，并將合成SCL-PHA的合酶基因phbC基因從5'端向3'端酶切，得到了不同程度酶切的雜合酶基因文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)的進(jìn)行尼羅紅篩選和基因大小的篩選得到了25株能夠合成PHB的重組菌，發(fā)現(xiàn)隨著雜合酶phbC的5'端的逐漸切除，其PHB合酶的活性也逐步降低。根據(jù)最近的報(bào)道是將PhbC氨基端82個(gè)氨基酸切除后還能保持一定體內(nèi)活性，85個(gè)氨基酸就完全失去活性，也就是是說(shuō)其最小功能區(qū)既是切掉

12、82個(gè)氨基酸之后的區(qū)域。我們通過(guò)構(gòu)建缺失體庫(kù)而獲得的雜合酶首次發(fā)現(xiàn)了在83-100甚至120個(gè)氨基酸缺失后仍然有活性。這就說(shuō)明，PHB合酶的遞增缺失發(fā)現(xiàn)其氮端的缺失可以通過(guò)PHA合酶PhaC1的互補(bǔ)進(jìn)行彌補(bǔ)。將失去活性的PHB合酶能夠再次合成PHB；通過(guò)遞增截短文庫(kù)法構(gòu)建的雜合酶，經(jīng)篩選得到了3株克隆，檢測(cè)這些酶發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)既可以利用葡萄糖為碳源合成PHB，也可以利用脂肪酸(癸酸鹽)為碳源合成P(HB-co-HA)共聚物，說(shuō)明了PhaC

13、1的氮端不僅僅是對(duì)雜合酶起到保護(hù)作用，而且可能含有底物的結(jié)合區(qū)域，因此能夠結(jié)合中長(zhǎng)鏈的羥脂酰CoA底物。這種人工改造的雜合酶性質(zhì)穩(wěn)定，易于控制表達(dá)，其延伸強(qiáng)度好等更加優(yōu)越的性能，接近于低密度聚乙烯，在不久的將來(lái)必會(huì)得到廣泛應(yīng)用。
　　 PHA合酶的性質(zhì)研究也是近年來(lái)備受關(guān)注的，PHA生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一就是提高PHA合酶的聚合能力。而聚合能力的提高與了解PHA合酶的催化以及結(jié)構(gòu)性質(zhì)密切相關(guān)。近年來(lái)普遍認(rèn)為，PHA聚合酶是以二聚體的

14、形式催化3-羥基丁酰CoA合成高分子量聚酯PHA的，從酶的催化機(jī)制可以推測(cè)在體內(nèi)酶的存在形式是單體與雙體的平衡狀態(tài)。并且認(rèn)為聚合酶的二聚體是酶存在的活性形式；PHB顆粒的形成存在兩個(gè)假說(shuō)，近來(lái)越來(lái)越傾向于“出芽”模型，即PHB顆粒是從內(nèi)膜上形成并脫落的，但是沒(méi)有直接證據(jù)證明以上理論的正確性。本論文首次通過(guò)綠色熒光蛋白(GFP)片段重組裝系統(tǒng)對(duì)PHB合酶的相互作用進(jìn)行了檢測(cè)，利用的是兩個(gè)在大腸桿菌中相兼容的載體分別為pET11a-NGFP

15、，及pMRBAD-CGFP，兩個(gè)載體上分別有GFP的兩部分片斷，通過(guò)將待檢測(cè)相互作用的兩個(gè)基因分別與NGFP、CGFP的融合表達(dá)，再將兩個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，表達(dá)融合蛋白后，只有當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生相互作用時(shí)，GFP兩部分相互靠近重組裝，從而發(fā)出熒光。結(jié)果證明：只有在有底物3-羥基丁酰CoA存在的情況下，重組菌才會(huì)發(fā)出熒光，說(shuō)明PHB合酶發(fā)生了相互作用，在體內(nèi)形成二聚體然后催化PHB的形成的。在沒(méi)有底物3-羥基丁酰