1、慢性乙型肝炎診斷與治療中的分子指標(biāo),楊志軍,乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀,全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國(guó)有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會(huì)出現(xiàn)肝硬化或肝癌而死亡,HBV病毒顆粒感染肝細(xì)胞及DNA復(fù)制過程,慢性乙肝的診斷,HBsAg持續(xù)陽(yáng)性6個(gè)月以上HBV-DNA高于105拷貝/毫升ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高,慢性乙肝的分類,HBeAg陽(yáng)性乙肝：HBsAg、HBeAg陽(yáng)性； HBV-DNA高于105拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高

2、或反復(fù)升高HBeAg陰性乙肝：HBsAg、anti-HBe陽(yáng)性； HBV-DNA高于104拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高,診斷慢性乙肝的指標(biāo),生化指標(biāo)：ALT免疫學(xué)指標(biāo)：HBsAg（攜帶指標(biāo)）、HBeAg（活動(dòng)指標(biāo)）病毒學(xué)指標(biāo)：HBV-DNAHBeAg陰性乙肝缺乏病毒活動(dòng)的免疫學(xué)指標(biāo)，前S1可以彌補(bǔ)這一缺憾，提供HBeAg陰性乙肝患者病毒活動(dòng)的免疫學(xué)指標(biāo),HBV-DNA檢測(cè)的基本要求,雖然國(guó)內(nèi)HBV-DNA檢測(cè)都用實(shí)時(shí)熒光

3、PCR法，但不同廠家的產(chǎn)品定量標(biāo)準(zhǔn)的賦值有差異，從而導(dǎo)致定量結(jié)果的差異，而準(zhǔn)確的定量結(jié)果直接影響到對(duì)病人的診斷以及治療方案的選擇HBV DNA定量試劑的溯源和標(biāo)準(zhǔn)化將是一種基本趨勢(shì),慢性乙肝治療的長(zhǎng)期目標(biāo),防止發(fā)展成為肝硬化或肝細(xì)胞癌在臨床上，往往以比較現(xiàn)實(shí)的短期目標(biāo)來代替長(zhǎng)期目標(biāo),慢性乙肝治療的短期目標(biāo),病毒抑制：表現(xiàn)為HBeAg血清轉(zhuǎn)換和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)肝損傷程度降低：表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常完全清除病毒：表現(xiàn)為HBsAg消失

4、，HBsAb出現(xiàn)，血清和肝細(xì)胞中檢測(cè)不到HBV-DNA從目前水平來看，不可能完全清除病毒,治療慢性乙肝的藥物,免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、PEG干擾素、胸腺肽核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋、替比夫定、恩替卡韋、泰諾福韋等,拉米夫定治療與轉(zhuǎn)氨酶濃度,拉米夫定治療一年后的HBeAg陰轉(zhuǎn)率和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率： ALT濃度低于2倍正常值高限：5% ALT濃度介于2-5倍正常值高限：26% ALT濃度高于

5、5倍正常值高限：64%,HBV-DNA定量檢測(cè)的臨床應(yīng)用,慢性乙肝診斷治療監(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià)跟蹤隨訪預(yù)后判斷,HBV-DNA定量— 慢性乙肝的診斷,HBsAg陽(yáng)性六個(gè)月以上ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高HBV-DNA大于105拷貝/毫升（HBeAg陽(yáng)性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）,HBV-DNA定量— 抗病毒治療的條件,ALT高于2×ULN（正常值上限）HBV-DNA大于105拷

6、貝/毫升（HBeAg陽(yáng)性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）ATL持續(xù)正常的患者可暫不進(jìn)行治療，每隔3-6個(gè)月隨訪肝功能、血清病毒學(xué)標(biāo)志物和進(jìn)行肝細(xì)胞肝癌監(jiān)測(cè) ALT水平在1-2倍ULN之間，需根據(jù)具體情況(如肝活檢結(jié)果等)， 在告知患者治療的利與弊、了解患者配合程度的前提下，決定是否實(shí)施治療。無論治療與否均應(yīng)密切隨訪，為治療提供更為科學(xué)的根據(jù),HBV-DNA定量— 慢性乙肝的治療監(jiān)測(cè),治療前檢測(cè)患者的基線水平（

7、ALT、HBV-DNA）治療開始后前三個(gè)月每月一次、以后每三個(gè)月一次檢測(cè)ALT、HBV-DNA，對(duì)于HBeAg陽(yáng)性患者，還需檢測(cè)HBeAg如果治療期間HBV-DNA水平降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，可以認(rèn)為治療有效,HBV-DNA定量— 療效評(píng)價(jià)（1）,生化學(xué)應(yīng)答：完全應(yīng)答：2次監(jiān)測(cè)ALT均復(fù)常(間隔1個(gè)月)；無應(yīng)答：ALT未恢復(fù)正常。值得注意的是評(píng)價(jià)生化學(xué)應(yīng)答時(shí)應(yīng)排除其他藥物或疾病對(duì)ALT升高或下降的影響,HBV-DNA定量—

8、 療效評(píng)價(jià)（2）,病毒學(xué)應(yīng)答：完全應(yīng)答按所采用的HBV DNA檢測(cè)方法說明書上提供的實(shí)驗(yàn)敏感性和檢測(cè)范圍確定，臨床上一般認(rèn)為采用國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)方法或敏感性相當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法檢測(cè)HBV DNA定量<105拷貝/毫升或斑點(diǎn)雜交法陰性為完全應(yīng)答；部分應(yīng)答為未達(dá)完全應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)但HBV DNA載量下降大于2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)；無應(yīng)答為未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn),HBV-DNA定量— 療效評(píng)價(jià)（3）,血清免疫學(xué)應(yīng)答：完全應(yīng)答為HBeAg

9、/抗HBe血清轉(zhuǎn)換；部分應(yīng)答為HBeAg陰轉(zhuǎn)但未出現(xiàn)抗HBe；無應(yīng)答為未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)。,HBV-DNA定量— 綜合療效評(píng)價(jià)（1）,完全應(yīng)答為療程結(jié)束時(shí)，生化學(xué)、病毒學(xué)和血清免疫學(xué)所有指標(biāo)均達(dá)到完全應(yīng)答,HBV-DNA定量— 綜合療效評(píng)價(jià)（2）,部分應(yīng)答為療程結(jié)束時(shí)，生化學(xué)、病毒學(xué)和血清免疫學(xué)指標(biāo)介于完全應(yīng)答和無應(yīng)答之間,HBV-DNA定量— 綜合療效評(píng)價(jià)（3）,無應(yīng)答為療程結(jié)束時(shí)，生化

10、學(xué)、病毒學(xué)和血清免疫學(xué)指標(biāo)均為無應(yīng)答 HBeAg陰性伴HBV DNA活躍復(fù)制的慢性乙型肝炎患者不進(jìn)行血清免疫學(xué)應(yīng)答評(píng)價(jià)，但應(yīng)進(jìn)行生化學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)的療效評(píng)價(jià),HBV-DNA定量— 何時(shí)可以停藥（1）,治療前HBeAg陽(yáng)性的患者，治療1年時(shí)綜合療效達(dá)到完全應(yīng)答者建議至少繼續(xù)用藥6個(gè)月，期間每3個(gè)月1次復(fù)查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)完全應(yīng)答者可停藥觀察,HBV-DNA定量— 何時(shí)

11、可以停藥（2）,治療前HBeAg陽(yáng)性的患者，治療1年時(shí)綜合療效達(dá)到部分應(yīng)答者建議繼續(xù)用藥直至達(dá)到完全應(yīng)答后，再繼續(xù)用藥至少6個(gè)月，期間每3個(gè)月1次復(fù)查ALT、HBV DNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)完全應(yīng)答者可停藥觀察,HBV-DNA定量— 何時(shí)可以停藥（3）,治療前HBeAg陽(yáng)性患者治療1年時(shí)綜合療效仍無應(yīng)答可停藥觀察，或改用其他有效的抗病毒藥治療。對(duì)于有肝臟組織學(xué)檢查等其它臨床指征顯示病情進(jìn)展合并肝功能失代償或

12、肝硬化的病人，不宜輕易停藥，并應(yīng)加強(qiáng)對(duì)癥保肝治療,HBV-DNA定量— 何時(shí)可以停藥（4）,HBeAg陰性伴HBV DNA活躍復(fù)制的慢性乙型肝炎患者，綜合療效完全應(yīng)答者療程至少2年；對(duì)于完成1年治療仍無應(yīng)答者可改用或加用其他有效 治療方案,HBV-DNA定量— 治療后的隨訪,無論有否治療應(yīng)答，都應(yīng)對(duì)患者定期隨訪。建議停藥后的前3個(gè)月每月1次、以后每3～6個(gè)月1次檢測(cè)ALT、AST、HBV血清標(biāo)志物和H

13、BV DNA，以及臨床表現(xiàn)和不良反應(yīng)。隨訪至少6-12個(gè)月。如病情有變化，可隨時(shí)隨訪。,HBV拉米夫定耐藥,雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長(zhǎng)期使用拉米夫定會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現(xiàn)拉米夫定耐藥突變（YMDD變異），大多數(shù)患者會(huì)在2-4個(gè)月之內(nèi)出現(xiàn)HBV-DNA和ALT反彈,YMDD變異檢測(cè),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測(cè)出現(xiàn)的突變類型（YVDD或

14、YIDD），而且能夠確定突變株所占比例，對(duì)及時(shí)調(diào)整治療方案具有非常重要的意義能夠準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測(cè)到1%的突變株，能夠更早發(fā)現(xiàn)耐藥突變，盡早調(diào)整治療方案,HBV 拉米夫定耐藥突變檢測(cè)試劑原理,HBV檢測(cè)I突變檢測(cè)V突變檢測(cè),YMDD的定量檢測(cè),采用選擇性引物，基于TaqMan實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，在三個(gè)平行反應(yīng)中分別擴(kuò)增總HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根據(jù)管間Ct值差異計(jì)算突變毒株在病毒群體中的比例,YMDD的

15、定量檢測(cè),YMDD的定量檢測(cè),YMDD的定量檢測(cè),YMDD的定量檢測(cè),YMDD的定量檢測(cè),與其它方法的比較,Comparison of results obtained by sequencing, pyrosequencing and real-time PCRTypesSequencingpyrosequencingreal-time PCRrtM20425 (36%)24 (35%)23 (33%)rtM204

16、I26 (38%)24 (35%)21 (30%)rtM204V18 (26%)19 (27%)20 (29%)rtM204I + rtM204V02 (3%)5 (8%),YMDD變異定性判斷的臨界值,定性判斷：ΔCt < 3.5，此時(shí)病毒群體中突變株比例大于10%與測(cè)序法比較，15例標(biāo)本結(jié)果完全符合,YMDD變異定性判斷的臨界值,什么時(shí)候開始檢測(cè)YMDD變異,拉米夫定治療過程中YMDD變異情況治療

17、時(shí)間 HBV DNA大于104copies/ml例數(shù) YMDD變異例數(shù)*< 6個(gè)月61（17%）6~12個(gè)月2614（54%）12~24個(gè)月3826（68%）24~36個(gè)月3838（100%）* 各組之間兩兩比較均有顯著差異（P<0.05）。,YMDD變異株的動(dòng)態(tài)變化,YMDD變異株的動(dòng)態(tài)變化,YMDD檢測(cè)試劑—應(yīng)用方法,對(duì)接受拉米夫定治療的慢性乙肝患者進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)治

18、療前檢測(cè)一次（約有10-20%的人在治療前就有YMDD變異）治療開始后第七個(gè)月開始，每三個(gè)月檢測(cè)一次拉米夫定耐藥、替比夫定耐藥（YIDD）恩替卡韋治療YMDD變異患者存在耐藥高風(fēng)險(xiǎn),慢性乙肝的基因分型,乙肝病毒分八個(gè)基因型：根據(jù)基因組序列的差異可以分為A～H八種亞型，我國(guó)以B型（41%）和C型（53%）為主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型對(duì)肝的損傷比B型嚴(yán)重，基因型C比基因型B更容易發(fā)展成為肝硬化不同的基因型對(duì)藥物的應(yīng)

19、答也不一樣：基因型B比基因型C對(duì)干擾素治療的應(yīng)答率高,HBV基因分型PCR檢測(cè)試劑,運(yùn)用多重、多色實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，分別對(duì)乙肝病毒（HBV）各種基因型序列進(jìn)行分析根據(jù)國(guó)內(nèi)HBV基因型的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)能檢測(cè)HBV A~D四種基因型特異性引物及探針研制開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)試劑盒,HBV基因分型—結(jié)果判斷方法,HBV基因分型—分型識(shí)別率,分型識(shí)別率＝（12+22）/35＝97％,HBV基因

20、分型—分型靈敏度（1）,HBV B型血清樣本靈敏度約在2×103IU/ml,HBV基因分型—分型靈敏度（2）,HBV C型血清樣本靈敏度約在1×103IU/ml,共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)檢測(cè),HBV cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板只有徹底清除了cccDNA，乙肝的治療才能算真正有效HBV cccDNA可作為評(píng)價(jià)抗病毒治療效果新的有效指標(biāo),HBV cccDNA PCR檢測(cè)試劑,運(yùn)

21、用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，根據(jù)乙肝病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）和雙鏈松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）分子結(jié)構(gòu)上的差異，即rcDNA負(fù)鏈上的缺口和正鏈的不完整性，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性cccDNA的引物，分別雜交于1500和2100鄰近區(qū)域(以EcoR I切點(diǎn)為物理起始原點(diǎn))，同時(shí)設(shè)計(jì)一條雜交于負(fù)鏈3’端近缺口處檢測(cè)探針，研制開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的HBV cccDNA實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)試劑盒。,HBV cccDNA檢測(cè)試劑原理,rcDNA不能被擴(kuò)增無

22、熒光信號(hào),cccDNA能被擴(kuò)增檢測(cè)到熒光信號(hào),阿德福韋治療乙型肝炎,阿德福韋為5’-單磷酸脫氧阿糖腺苷類似物，可明顯抑制HBV DNA復(fù)制 HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年時(shí)的耐藥發(fā)生率分別為0%、1.6%、3.1%HBeAg陰性者1、2、3年的耐藥發(fā)生率分別為0%、3.0%、5.9%~11%,阿德福韋耐藥突變位點(diǎn),rtN236T、rtA181V/T,恩替卡韋治療乙型肝炎,拉米夫定耐藥的病毒株對(duì)恩替卡韋敏感性降低8至3

23、0倍；發(fā)生YMDD變異患者治療1 年時(shí)對(duì)恩替卡韋耐藥發(fā)生率為5.8%，并出現(xiàn)相關(guān)的位點(diǎn)變異。,恩替卡韋耐藥突變位點(diǎn),如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和/或rt M204V/I，rtT184，rtS202和/或rtM250等位點(diǎn)變異將造成對(duì)恩替卡韋耐藥,HBV耐藥與分型同時(shí)檢測(cè),HBV耐藥與分型同時(shí)檢測(cè),1896突變的診療意義,G1896A點(diǎn)突變，形成終止密碼子 (TAG)，不表達(dá)HBeAg；由于e抗原不能合成，血清中檢測(cè)不到HB

24、eAg，但乙肝病毒仍處于復(fù)制狀態(tài)；此類HBeAg陰性乙肝患者更容易發(fā)生嚴(yán)重的肝臟疾病，需接受更為長(zhǎng)期的抗病毒治療。,基因檢測(cè)在乙肝診療各階段的應(yīng)用,藥物治療方案的確定（用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）,藥物治療（療效評(píng)價(jià)）,前C區(qū)1896位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒,跟蹤隨訪,,,,乙 肝 病 毒 定 量檢測(cè) 試 劑 盒,確診,病毒學(xué)分析,乙肝病毒分型檢測(cè)試劑盒,拉米夫定耐藥檢測(cè)試劑盒,阿德福韋耐藥檢測(cè)試劑盒,,,,共價(jià)閉合環(huán)