1、本論文采用急性毒性實驗方法，研究了鎘(Cd2+)對長江華溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）鰓組織細胞凋亡的影響。實驗設置五個濃度組(7.25、14.50、29.00、58.00和116.00 mg·L-1)和一個對照組，處理時間24、48、72和96 h。首先，利用顯微與亞顯微技術、吖啶橙和溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色法、原位末端標記法(TUNEL)以及瓊脂糖凝膠電泳法，從細胞形態(tài)學和生物化學水平檢測了鰓組織細

2、胞的凋亡。其次，為了探討Cd2+誘導細胞凋亡的途徑，對不同濃度Cd2+處理鰓組織48 h，半胱天冬酶-3(caspase-3)、半胱天冬酶-8（caspase-8）、半胱天冬酶-9（caspase-9）活力進行了測定。之后，就Cd2+誘導鰓組織細胞凋亡的機制做了進一步研究。以不同濃度Cd2+處理48 h檢測乳酸脫氫酶(LDH)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活力，以及過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)，超氧陰離子(O2-·)含量。

3、另外，在細胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3基因方面也做了初步研究。通過提取鰓組織細胞總RNA，cDNA第一鏈的合成、特異性引物設計、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳以及產物回收，獲得一條核苷酸序列并進行了測序分析。具體結果如下:
　　(1)經(jīng)Cd2+處理后，顯微與亞顯微觀察檢測到了典型的細胞凋亡特征，具體表現(xiàn)為核邊集、核膜折疊、核染色質致密濃縮、核裂解形成凋亡小體等現(xiàn)象;瓊脂糖凝膠電泳圖譜出現(xiàn)凋亡細胞所特有的DNA梯狀條帶。隨著Cd2+

4、濃度的增加和處理時間的延長，凋亡細胞所占比例呈現(xiàn)先升后降的趨勢，凋亡指數(shù)的變化表現(xiàn)出顯著的劑量與時間-效應關系。隨著Cd2+濃度的增加，caspase-3、caspase-9、iNOS活力逐漸升高，且酶活力的增高與凋亡指數(shù)的上升呈正相關關系;caspase-8活力較對照組無顯著性差異，與凋亡指數(shù)變化相關度較低。
　　(2)處理48 h，隨著Cd2+濃度的增加，凋亡細胞數(shù)較對照組比較均出現(xiàn)了不同程度的增加;LDH活力不斷上升，但是較

5、對照組差異不顯著;O2-的含量先升后降;·OH含量一直處于被抑制狀態(tài);H2O2含量沒有發(fā)生顯著變化。
　　(3)實驗得到了一條核苷酸序列，經(jīng)分析其中一部分與凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei中caspase-3基因片段相似度極高，另外一部分片段與大腸桿菌Escherichiacoli體內的功能蛋白基因即蛋白復制基因片段相似度極高。處于上下游的兩個基因片段有重疊部分，經(jīng)分析重疊部分有與啟動子相似度極高的核苷酸序列，該基

6、因可能參與了蛋白質表達調控機制。
　　結論:
　　(1)鎘能夠引起長江華溪蟹鰓組織細胞凋亡;細胞凋亡的檢測以及凋亡指數(shù)的變化能夠靈敏反映鎘對水生動物的脅迫程度及毒性大小，可作為水生態(tài)環(huán)境鎘污染程度的生物指標。
　　(2) Cd2+處理48 h，長江華溪蟹鰓組織細胞膜發(fā)生了輕微損傷，但是沒有達到膜內物質泄漏的程度;活性氧中的三個重要組成成員可能不是誘發(fā)細胞凋亡的因素，而可能是一氧化氮介導了氧化脅迫引起的細胞凋亡。