1、地貧篩查中的血紅蛋白電泳操作技術(shù) 解放軍第三0三醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室王榮新,血紅蛋白的組成,血紅蛋白由血紅素與珠蛋白組成血紅素：鐵原子與原卟啉Ⅸ復(fù)合物。珠蛋白：包括α、β、γ、δ、ε和ζ珠蛋白6種。 血紅蛋是由兩種不同的鰲合了血紅素的珠蛋白肽鏈所形成的四聚體結(jié)構(gòu)，在人體的不同發(fā)育時(shí)期，其主要的血紅蛋白（Hb）組成不同。,人體發(fā)育過程中Hｂ的組成,Hb的種類,A.正常的Hb分三類 a.HbA(α2β2

2、) b.HbF(α2γ2) c.HA2(α2δ2)B.異常Hb有兩類 a.快速異常Hb:穩(wěn)定Hb b.慢速異常Hb:不穩(wěn)定Hb,基層常用的電泳分析方法,醋酸纖維膜電泳瓊脂凝膠電泳,,醋酸纖維膜電泳→主要過程←瓊脂凝膠電泳 ↓ RBC洗滌

3、 ↓ 制備溶血 ↓ 點(diǎn)樣 ↓ 電泳 ↓ 染色與脫色 ↙↘掃

4、描法 ↙ 比色法:分區(qū)剪下色帶，洗脫 分區(qū)切割色帶,融化瓊脂，干燥,透明→比色,,血紅蛋白電泳設(shè)備,醋酸纖維膜電泳,,,HbA2的常用測定方法,原理:根據(jù)不同Hb自帶電荷的不同、分子量大小的不同、結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的不同,在一定pH值的緩沖液中朝特定方向泳動(dòng)，在一定的電壓下經(jīng)一定時(shí)間，可分離出各自的區(qū)帶。主要類別:醋酸纖維素膜電泳法瓊脂凝

5、膠電泳法HbA2含量測定:洗脫法掃描法,血紅蛋白A2測定,不連續(xù)電泳將HbA2分離后，分別剪出膜條中的HbA和HbA2區(qū)帶，分別放入試管中，HbA加蒸餾水20ml， HbA2加4ml，浸泡30分鐘，不定時(shí)搖動(dòng)，使Hb完全冼脫下來后混勻，用721分光光度計(jì)以波長413nm蒸餾水校正零點(diǎn)，讀取光密度OD值并計(jì)算出結(jié)果。,抗堿血紅蛋白(HbF)測定,設(shè)備：721分光光度計(jì)，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗，濾紙。試劑：1/12m

6、ol/LKOH或NaOH溶液，酸性半飽和硫酸銨溶液。方法：取兩支試管，測定管加入溶血液0.1ml，對照管加入0.02ml，于測定管中加入KOH1.6ml，搖勻，1分鐘時(shí)立即加入酸性半飽和硫酸銨溶液3.4ml，倒轉(zhuǎn)6次，放10分鐘，濾取溶液檢測，用波長 540nm 蒸餾水校正零點(diǎn)，分別讀取測定管和對照管光密度OD值，計(jì)算出結(jié)果。,,HbCS的區(qū)帶多在HbA2位置的前后，含量低，2％左右，很不穩(wěn)定，有時(shí)還可分開成三或四小區(qū)

7、帶，用聯(lián)苯胺染色可確定。HbE為慢速異常區(qū)帶，其位置相當(dāng)于HbA2。HbH和HbBart’s為快速異常區(qū)帶。,全自動(dòng)Hb電泳儀,目前國內(nèi)使用的主要有美國的Helena電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。法國的Sebia電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。國產(chǎn)的金桑特電泳儀、掃描儀和分析系統(tǒng)。1.通過掃描定量給出HbA、 HbA2和HbF值。2.異常區(qū)帶通過查表確定。,HbE區(qū)帶的鑒別,A.聯(lián)苯胺染色,鑒定是否為Hb B.區(qū)帶位于HbA2

8、 區(qū)帶位置上,在陰性(-)泳動(dòng)速度最慢的一種異常Hb,難與A2區(qū)分開C.HbA2定量在10%以上,應(yīng)考慮為HbE D.HbE純合子只有HbF和HbE,HbE高達(dá)95%以上,HbH區(qū)帶的鑒定,A.聯(lián)苯胺染色,確定是否為Hb B.在陽極(+)泳動(dòng)速度最大的Hb區(qū)帶C.HbH包含體陽性(+) D.pH6.5緩沖液(酸性)唯一向陽性(+)移動(dòng)的Hb區(qū)帶E.Hb↓MCV↓MCH↓F.HbBart’s 區(qū)帶在HbH區(qū)帶后,泳動(dòng)速度比

9、HbH稍慢 些,有Bart’s 區(qū)帶,一般都有H區(qū)帶,H含量高達(dá)30% 多,但不會(huì)超出40%,低少到1%左右。,HbA2 在血紅蛋白病中的意義,HbA2組成: α2 δ2HbA2參考值:1.2%-3.5%HbA2含量的改變: HbA2水平升高,是β地貧基因攜帶者的特征性標(biāo)志, 故HbA2定量的準(zhǔn)確與否,對于臨床一線β地貧基因攜帶者的篩查至關(guān)重要。,血紅蛋白（Hb）病,1.血紅蛋白?。夯蛲蛔儗?dǎo)致合成的珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異

10、常（如：鐮狀細(xì)胞血紅蛋白病/HbS）2.地中海貧血：基因突變導(dǎo)致一種或多種珠蛋白肽鏈合成減少或缺如（α/β地貧）3.獲得性血紅蛋白?。航佑|或誤服化學(xué)藥物,,Hb病為世界上發(fā)病率最高危害最大的單基因遺傳病，被WHO列為嚴(yán)重危害人類健康六大疾病之一。 全球約有4.83%的人口攜帶Hb病基因,每年各類重型地貧(包括地貧復(fù)合異常Hb病類型)患兒的出生率不低于2.4‰。據(jù)此推算,全球每年至少約35萬Hb病患兒出生;

11、 至今為止，全球在分子水平上已鑒定出近1000種不同的珠蛋白突變基因，其中包括700多種異常Hb變異體和200余種β地貧基因以及70多種α地貧突變,其中中國人群中異常Hb、β地貧基因和α地貧突變各占70多種、34種和11種。,臨床常見的異常血紅蛋白,以速度快慢排序 1.血紅蛋白E/A2 2.血紅蛋白D/S3.血紅蛋白G 4.血紅蛋白K 5.血紅蛋白J6.血紅蛋白H,Hb電泳操作中的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn),1.RBC洗滌：離

12、心的速度和時(shí)間要夠，生理鹽水與血 比例要5：1，血漿與冼滌生理鹽水要盡量吸干凈。2.制備溶血：加入的溜水、溶血?jiǎng)┡c紅細(xì)胞體積要 符合要求。離心的速度和時(shí)間要夠。3.點(diǎn)樣:血紅蛋白液適量，不能太寬。4.電泳:醋纖膜浸泡時(shí)間要夠長，平衡時(shí)間要夠。5.染色與脫色:時(shí)間要夠。,1.正常新生兒 9.輕型β地中海貧血2.胎兒水腫綜合征 10.異常HbD雜合子3.

13、α地中海貧血1(臍血) 11.異常HbG雜合子4.HbCS-HbH病型 12.輕型β地中海貧血復(fù)合HbE5.重型β地中海貧血復(fù)合HbE 13.正常成人 6.輕型β地中海貧血 14.正常成人 7.異常HbK雜合子 15.HbH病8.異常HbJ雜合子,謝謝！地貧防治網(wǎng)站：www.303dp