1、1,,HIV/AIDS 實驗室檢測,首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院首都醫(yī)科大學傳染病研究所魏紅山,要點概述,,2,HIV實驗室檢測的基本目的,為HIV感染提供確認，病程監(jiān)控，以及預后判定提供依據(jù)為輸血提供安全保障，用于獻血員篩查服務于自愿咨詢人員，提供自愿健康體檢篩查服務于特殊的醫(yī)療過程，如器官移植，手術，輸血前后的篩查治療方案的規(guī)劃與調整，如耐藥檢測，分型檢測,3,HIV感染過程中的病原學及免疫學標志物,HIV實驗室檢測的

2、病原學基礎,4,法國巴斯德研究所Montagnier和美國人類病毒學研究所Gallo分離并鑒定，因該項成就Montagnier等人獲2008年度諾貝爾獎。,5,病毒顆?；窘Y構Core核心: Viral nucleic acid (DNA or RNA)Capsid衣殼: Protein shell Core + Capsid = nucleocapsid

3、 (核殼體）Envelope包膜：Spike刺突,Naked virus：裸露病毒: Nucleocapsid = virion. Enveloped virus：包膜病毒:Nucleocapsid + Envelope = virion Special structure：特殊結構: e.g. 逆轉錄酶,RBC直徑約為10000 nm

4、,HIV 基因組結構及編碼蛋白特征,啟動轉錄,核心蛋白（核殼膜）,編碼代謝酶,編碼受體結合蛋白,,,,,,9200 bp,,,結構基因,env基因：gp120，gp41gag基因：p17，p24,功能基因：,pol基因：逆轉錄酶，蛋白酶，整合酶,功能輔助基因：調節(jié)結構基因、功能基因轉錄與表達 Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，Nef,,,HIV基因組,7,Env刺突

5、由3個gp120亞單位非共價連接，與3個gp41亞單位形成的異源性三聚體蛋白位于病毒顆粒的外側。Gp120與CD4結合后，暴露輔受體結合位點，gp120與輔受體CCR5和CXCR4結合Gp41介導病毒顆粒與細胞膜的融合，將核殼體釋放到靶細胞內。病毒逆轉錄酶 介導RNA逆轉錄成cDNA，通過核孔轉移至細胞核，形成整合前復合體。病毒整合酶 催化HIV基因組整合到人體染色體上。轉錄形成病毒mRNA。病毒mRNA轉移出細胞核，翻譯成病毒

6、蛋白。Gag蛋白，病毒基因組RNA，env糖蛋白復合體，以及GagPol前體蛋白組裝病毒顆粒發(fā)生于漿膜側。Gag蛋白上的頂端正電堿性片層，引導Gag定位與漿膜上的磷脂酰肌醇結合區(qū)。病毒蛋白與病毒基因組mRNA組裝成新病毒顆粒。伴隨新病毒顆粒的釋放，病毒蛋白酶 清除Gag和GagPol多聚蛋白前體，導致病毒顆粒成熟和釋放。,HIV env基因編碼包膜糖蛋白的基本結構,,,9,圖1. env蛋白的三聚體結構及其光譜中和表位的分布.,M.

7、J. van Gils, et al. Virology 2013;435: 46–56,HIV入侵細胞基本機制,Klasse PJ. Cellular Microbiology 2012;14:1183–1192.,HIV包膜蛋白細胞內穿行與病毒顆粒的組裝,J Mol Biol 2011;410:582-608,HIV組裝基本機制,,蛋白酶抑制劑作用靶點,J Bio Chem 2012;287:40867-40874,Nature

8、2011;469:424-427,HIV感染過程中的病原學及免疫學標志物,HIV感染后病毒學參數(shù)變化特征,HIV感染后感染后，血液中最早可以檢測的標志物是HIV RNA和p24抗原。其中病毒RNA最早可以在感染后2周內檢出。隨后滴度逐漸增加，在感染后的2個月可以高達200萬拷貝/毫升血漿。同時出現(xiàn)體液和細胞免疫反應。這些免疫反應可以控制HIV復制，并可以大幅度降低RNA水平，使RNA水平達到一個恒定的水平，即所謂的調定點。根據(jù)這個

9、調定點的水平可以預測隨后感染的病程特征：調定點水平越高，疾病進展就越迅速，就會越快進展到AIDS。相反，調定點水平越低，疾病的進展就越緩慢。在感染的后期階段，RNA水平再次逐漸增加，并在AIDS相關癥狀出現(xiàn)時再次達到一個很高的水平,14,某公司試劑檢測HIV/AIDS，相應標志物的變化特征,AIDS實驗室檢測基本方法,診斷性檢測,初篩實驗：IFA、ELISA:1985第一代試劑開始使用確認實驗：Western blot，線性印跡,預

10、后判定性檢測,T細胞亞群檢測：流式細胞儀技術HIV RNA檢測：幾種核酸技術,HIV耐藥檢測,表型耐藥：細胞培養(yǎng)技術基因型耐藥：序列測定，雜交技術,,16,初篩實驗：雙抗體夾心ELISA的基本原理,HIV ELISA診斷試劑的歷史沿革,18,19,HIV/AIDS快檢試劑,原理：乳膠凝集、免疫斑點和免疫層析，金標法最多，可進行全血、血清、以及尿液檢測特點：費時短、不要求特殊設備、適用于應急和基層使用，最大缺點是價格高，敏感度和特異

11、度低于EIA，不適于城市內的血液篩查。,,20,確認實驗：Western blot基本流程,美國CDC：2條帶應該分別是gag和env基因產物WHO：可以是env基因產物兩條帶美國紅十字會：應該至少gag, env, pol基因各顯示1條帶,確認實驗結果判定,22,一旦確診感染HIV，重要的是對病情進行監(jiān)控，并給予合理抗病毒治療，以延緩病情的進展。病毒抗原檢測－－－最早用于預后判斷，但目前已經基本被CD4檢測縮替代，觀察P24抗

12、原應該考慮到晚期表達水平下降的問題。病毒載量檢測 – 直接評估 HIV-RNA 常用的方法包括 RT-PCR, NASBA, 以及 bDNA. 是目前常用的技術。T細胞亞群檢測是目前判定患者預后及決定治療方案的重要方法。,預后判定檢測,,23,T細胞亞群檢測的病理依據(jù)及意義,數(shù)量下降：細胞毒素和自然殺傷細胞引起。外周細胞凋亡, 未分化細胞死亡。淋巴腺空泡和特殊的凋亡。,功能喪失： 分布外周血中的在幼稚和記憶和其它未知功能

13、細胞變化導致免疫反應削弱。,,評價免疫功能減退的程度和AIDS進程指導治療策略的制訂確定預防機會感染的最佳時機監(jiān)控抗逆轉錄病毒（ARV）治療、細胞因子治療和保護治療性疫苗的療效,24,25,液流系統(tǒng) — 利用鞘液（FACSFlow Sheath Fluid）將細胞依序送至測量區(qū)受檢光學系統(tǒng) — 利用雷射光源、透鏡、光柵、濾片與反射鏡等激發(fā)並收集細胞產生之螢光與散射光，並導至各探測器內電子系統(tǒng) — 1.將探

14、測器測到的光學訊號轉換為電子訊號2.分析所輸出的電流訊號，以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示3.量化並放大訊號傳至電腦,流式細胞儀的基本組成,26,BD FACSCaliburTM 多色分析儀,,,Dichroic Mirrors,Bandpass Filters,,,,,,Detector#1,Detector#2,Detector#3,Detector#4,CD3,CD19,CD45,CD14,CD14,CD14

15、,CD16/CD56,31,,,Suppressor T cell,T cell / B cell,,,CD45 PerCP,SSC,流式細胞儀T細胞亞群絕對計數(shù)原理,MMWR, 2003: 52(RR02);1-13,32,RT-PCRbDNANASBALCx,HIV RNA檢測的方法,RT-PCR、NASBA檢測屬于PCR方法，其中包括抽提RNA的步驟，所以較容易受污染，而使RNA降解bDNA與RT-PCR、NASBA相比較

16、有較好的穩(wěn)定性、線性和可重復性,,特殊人群：懷疑急性期感染者，母嬰傳播，核酸檢測能夠提供早于免疫學指標的診斷，已經被認為是18個月以下嬰幼兒診斷的金標準。除早期診斷外，HIV RNA測定能夠監(jiān)測HIV慢性感染者病情的發(fā)展。以及作為評價HAART治療效果的評價指標。應用核酸雜交法或應用PCR法檢測HIV的前病毒DNA可確定細胞中HIV潛伏感染情況。由于其固有的高敏感性，某些國家已經采用這種技術用于獻血員的篩查，被認為與經典免疫學篩

17、查方法相比，可以降低輸血傳播約50%。,33,NASBA 技術,NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) 早期產品為NASBA HIV-1 RNA QT定量RNA測定方法，現(xiàn)已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT assay取代。NASBA技術是一種等溫擴增系統(tǒng)，其擴增基礎在于系統(tǒng)內的混合酶系統(tǒng)，此系統(tǒng)內含有逆轉錄酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶，以在體外

18、模擬逆轉錄病毒體內復制過程。,Triton X-100裂解病毒提取核酸加入銣標記的內標電化學發(fā)光檢測根據(jù)內標計算野生株拷貝數(shù),,34,RT-PCR 技術,基本原理是通過逆轉錄酶的作用將樣品中RNA逆轉錄合成DNA后進行聚合酶鏈式反應（RT-PCR），方法較為簡單異硫氰胍裂解液裂解病毒，釋放出核酸成分。加入一個已知拷貝數(shù)量的合成RNA分子作為定量標準（QS），然后進行RNA提取。使用引物在逆轉錄酶的作用下逆轉錄產生142堿基的

19、gag基因片段（DNA），通過PCR方法對此基因片段進行擴增。清洗掉未雜交的反應產物后再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，親和素與擴增產物上的生物素結合HRP的底物進行顯色反應，測定OD值。,,35,bDNA 技術,bDNA測定技術基于其獨特的信號放大系統(tǒng)，即bDNA信號放大系統(tǒng)，這是一個人工合成的bDNA，bDNA的分枝可結合多個酶標記物，從而將病毒的信號放大，以便進行檢測。此檢測系統(tǒng)不涉及核酸擴增反應首先將血漿樣品離心

20、，濃縮其中的病毒顆粒，HIV RNA釋放后加入微孔板中板孔中包被有可與病毒特異結合的一系列靶探針，靶探針的一端可標記在游離的病毒核酸鏈上，另一端可與bDNA結合，加入酶標記物對結合的bDNA進行標記經過清洗后加入底物進行反應，測定反應強度,本方法定量系統(tǒng)中沒有內標記物，每次實驗設置一系列外部標記，通過實驗樣品反應強度與外部標記樣品強度的比較確定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。,,36,HIV RNA 應該在感染后從血清轉換至AIDS 全程可以

21、檢測地到。但實際感染者中許多血清HIV RNA 水平并不高，有些患者在無癥狀階段甚至低于400 拷貝/毫升。對于一些敏感性不高的試劑盒，該階段可能會出現(xiàn)HIV RNA 檢測陰性的結果。其它一些因素也會影響檢驗結果的準確性,地理因素感染亞型和循環(huán)中病毒重組的影響病毒變異導致擴增引物特異性變化病毒準種復雜性,HIV RNA檢測結果解讀注意事項,37,近期HIV感染患者的識別:STARSH分析,新近感染的識別有助于HIV傳播模式的評價

22、新近HIV血清學轉換測試算法（STARSH）是一系列分析方法這些分析方法主要是基于HIV感染后一系列典型的免疫學事件這些分析方法一旦在HIV特異性抗體生成，并不能鑒別哪些患者是慢性感染者，哪些是新近感染者,總體評價,38,近期HIV感染患者的識別:STARSH分析,常用方法,“失調”分析（detuned assay）該技術基于HIV感染早期階段誘導機體所產生的抗體親和力和滴度都比較低，而隨著疾病的進展，HIV特異性抗體的親和力

23、和滴度都逐漸升高。因此，聯(lián)合一種高敏感試劑盒和相對低敏感試劑盒對標本進行分析即可達此目的。BED-捕獲酶免分析（CEIA）BED-捕獲酶免分析是一種商用產品，其原理是基于HIV-特異性IgG抗體占血清總IgG抗體比例，藉此推斷感染大致時間。早期感染，HIV特異性IgG占總IgG比例較慢性感染低，并隨著感染時間延長而逐漸增加。,39,近期HIV感染患者的識別:STARSH分析,常用方法,親和指數(shù)分析這種方法是基于HIV感染越早

24、，HIV抗原與誘導產生的抗體親和力越低的事實。基于抗原-抗體的親和力指數(shù)對感染時間進行判定。具體來說，將患者的血清標本首先采用離液劑，諸如鹽酸胍，斷開維持抗體二級結構及與抗原相互作用的氫鍵。然后重新對抗體親和性進行分析。IDE-V3免疫分析IDE-V3免疫分析是一種基于env編碼糖蛋白上的兩個保守的免疫表位：一個表位在gp41上，另一個表位在gp120上的V3區(qū)。根據(jù)不同寡肽的抗體親和模式，可以將感染分為180內的感染和180天

25、后的感染,40,STARSH分析受很多因素的影響：主要有以下幾點：,近期HIV感染患者的識別:STARSH分析,影響因素,HIV的高度變異性仍然是主要因素，不同分離株之間免疫優(yōu)勢表位的差異，必然影響抗體的差異病程的限制，諸如AIDS階段患者抗體的濃度低下HAART治療的影響，藥物治療可以顯著影響體內病毒株的準種進化，因而對檢驗結果也有相應的影響,41,AIDS目前臨床領域內面臨的問題：疫苗&耐藥,不同亞型之間gp120的差異

26、高達35%. 有效誘導廣譜中和抗體的表位，深埋于蛋白結構內部。尚不清楚控制HIV-1復制免疫反應的實質，諸如免疫反應的控制，血清陰性患者的高危因素,Taylor, B.S., et al. N. Engl. J. Med. 2008;358:1590–1602.,Barouch, D.H., 2008. Nature 455, 613–619.,Lederman, et al., J. Infect. Dis.2010;202:S3

27、33–S338.,HIV抗病毒治療的目的,延緩病情進展恢復免疫系統(tǒng)的功能改善患者的生存質量,HIV抗病毒藥物的分類及方案,核苷類逆轉錄酶抑制劑：競爭逆轉錄酶的底物非核苷類逆轉錄酶抑制劑：與逆轉錄酶的轉錄活性位點p66疏水口袋結合，阻斷逆轉錄酶異位，位點專一高效蛋白酶抑制劑侵入抑制劑和融合抑制劑整合酶抑制劑,高效的抗病毒治療方案需要3種或3種以上藥物聯(lián)合使用。截止2008年3月，F(xiàn)DA批準了1種進入抑制劑，1種融合抑制劑，1

28、種整合酶抑制劑，17種逆轉錄酶抑制劑，11種蛋白酶抑制劑。,HIV耐藥產生的原因：,自發(fā)突變-原發(fā)性耐藥藥物壓力選擇-繼發(fā)性耐藥,每天體內大約產生1010個病毒顆粒，每個核苷酸位點每次復制變異頻率為3×10-2，多位點變異導致逆轉錄酶和蛋白酶空間結構變化，使HIV對藥物不再敏感。,不規(guī)范的治療、不合時機的給藥都會導致耐藥的產生。,HIV耐藥的基本認識,44,當1種或1類抗HIV藥物不再有效，則被認為HIV耐藥。HIV

29、-1耐藥意味著病毒可以在藥物環(huán)境中適應，生長，以及復制。HIV感染者3/4的患者治療失敗與耐藥有關約1/4的新感染患者已經對至少1類抗HIV藥物耐藥（原發(fā)耐藥）,耐藥產生的分子機制,蛋白酶抑制劑：1）結合位點變異導致酶與競爭底物（藥物）結合力降低；2）催化部位變異導致代償性催化活性增強核苷類似物類逆轉錄酶抑制劑導致的突變多發(fā)生于5’-端編碼區(qū)非核苷類似物：1）逆轉錄酶空間構象改變；2）增強焦磷酸水解，使DNA合成加速,HIV耐藥

30、檢測的意義,為臨床提供患者治療方案抉擇的整體信息：病史，病毒載量，以及CD4+T計數(shù)避免使用已經耐藥的藥物，降低患者的副作用及治療費用有效治療方案，藥物篩選的依據(jù),何時進行HIV耐藥檢測？,抗病毒治療前：1）明確原發(fā)性耐藥；2）動態(tài)監(jiān)測耐藥進展特征治療失敗后：明確何種藥物，或何種方案不再有效全程監(jiān)控：明確耐藥位點動態(tài)變化與耐藥表型之間的關系,那些藥物耐藥？,美國的部分資料顯示,76%的病毒株至少對一種核苷類似物藥物耐藥對蛋白酶

31、抑制劑耐藥率40.5%對非核苷類逆轉錄酶抑制劑耐藥率25.2%對2種或3種治療藥物同時耐藥率分別為47.1%和13.1%,Richman DD, et al. AIDS 2004;18:1393-1401,我國的部分資料顯示,初治6個月，耐藥發(fā)生率62.7%新發(fā)患者15%的患者攜帶耐藥株,Zhang X, et al. AIDS 2007;21Suppl8:S53-S57,基因型耐藥檢測,原理：RT-PCR獲取RT、PR基因，然后

32、進行分子雜交或核酸測序。方法：,特異性引物擴增差異雜交分析線性探針分析基因芯片分析,48,能夠提供治療方案中每種藥物的耐藥情況，是對耐藥的直接測量結果容易理解對病史，治療方案復雜的患者，結果容易理解便于新藥耐藥分析便于新突變位點的識別,僅能對優(yōu)勢耐藥株的耐藥情況進行分析， 1000 copies/ml費用較高檢測周期較長：3~4 周,測序分析,能直接測出HIV-1對藥物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐藥情況，

33、有利于指導HIV-1感染者有效地用藥。目前市面上供應試劑盒已有2種，即AV（Vicro Antivirogram）和PS（Virologic PhenoSense），兩者方法均應用從生長于載體中的HIV-1而獲得的重組病毒和病人標本中蛋白酶與逆轉錄酶序列，分析與野病毒之間IC50值相差倍數(shù)，一般達5—10倍以上為陽性。各種藥物引起HIV變異其位點不一樣，這種方法的最大優(yōu)點是可以獲得各種藥物耐藥量度數(shù)據(jù)，但不足的是試驗慢又昂貴，技術要

34、求高。,HIV表型耐藥性測試方法,52,鑒別混合病毒株中，突變的水平在10%-50%結果由一定的“預測”性，可能在實際耐藥前檢出實驗周期短：< 2 周費用低,需要病毒載量>500~1000 copies/ml難以明確次要病毒株的變異對結果的理解需要一定的基礎知識背景，關聯(lián)性分析等不同實驗室之間分析方法，對結果的理解有差異,虛擬表型分析法,原理：用基因型結果解釋表型類型。特點：需要建立基因型相關表型數(shù)據(jù)庫。,能夠

35、把復雜的基因型資料轉化為簡單的表型資料，便于臨床醫(yī)生理解、決策。對NNRTIs和PI類藥物預測較好；對NRTIs預測較差。需要建立經驗性數(shù)據(jù)庫。,56,Stanford University HIV Resistance Database: http://hivdb.stanford.edu/ UCSF Database of Antiretroviral Drug Interactions: http://hivinsite.

36、ucsf.edu/insite?page=ar-00-02 HIV Drug Interactions: http://www.hiv-druginteractions.org/,HIV耐藥的預防,治療方案的依從性是預防耐藥的關鍵環(huán)節(jié)：每劑，每次，每天的依從性避免HIV-1感染的傳播，是原發(fā)耐藥株的傳播核心阻斷環(huán)節(jié),AIDS初篩實驗室的管理及質量控制,必要性：HIV檢測實驗室的室內質量控制與室間結果比較對HIV檢測結果的持續(xù)改進

37、非常重要。這是因為：,許多測試方法可以用于HIV感染或AIDS的診斷。同一HIV測試方法在不同的實驗室/不同測試人員往往給出不同的測試結果許多影響因素可以導致HIV檢測結果的變異：,包括制造商試劑盒的質控變化操作人員技術熟練程度病毒的遺傳變異選擇用于評價測試性能的“金標準”或“參照標準”的使用尤其是測試前對HIV陽性的估計,59,AIDS初篩實驗室的管理及質量控制,1992年WHO即對HIV測試方法的選擇等給出了相應的推薦意

38、見，并在1997年對這個推薦意見進行了修改。2004年我國即出臺了《全國艾滋病檢測技術規(guī)范》(2004年版) 2009年國家CDC針對標本的采集、某些檢測方法、特殊人群檢測等問題，對2004年規(guī)范進行了修正，即目前的《全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2009年版）》。與2004年版相比，該版增加了有關HIV-1耐用檢測相關內容及實驗室生物安全及實驗室質量管理相關內容,HIV實驗室質控管理,60,,2003年9月新加坡國立大學科研人員在環(huán)境

39、衛(wèi)生研究院實驗室中感染SARS病毒。2003年12月1名臺灣的SARS研究人員在“國防預防醫(yī)學研究所”實驗室感染SARS病毒。2004年4月安徽、北京先后發(fā)現(xiàn)新的SARS 病例，經證實分別來自于在中國疾病預防控制所實驗室受到SARS感染的2名工作人員。,實驗室生物安全問題……,61,AIDS初篩實驗室的管理及質量控制,HIV實驗室生物安全管理,1990年2月12日衛(wèi)生部即正式批準了《HIV檢測管理規(guī)范》（試行），其中即對HIV檢測實

40、驗室的設置，必要的條件，生物安全等問題給出了明確的規(guī)定。1997年《全國艾滋病檢測工作規(guī)范》明確要求：二級生物安全實驗室基本要求：,HIV相關血清學檢測要在生物安全II級實驗室內進行進行HIV分離、培養(yǎng)與擴增、濃縮與純化、中和試驗等檢測工作的，需要在三級生物安全實驗室內進行。,布局上嚴格劃分為清潔區(qū)、半清潔區(qū)，以及污染區(qū)3個區(qū)域裝備生物安全柜,62,THANKS,魏紅山首都醫(yī)科大學傳染病研究所Tel： 10-8432