1、動物細胞培養(yǎng),中山大學實驗動物中心,前 言,1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術語。1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)。由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學研究中的應用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細技術。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細

2、胞系（Gey，1952），可用來進行一系列研究，更加促進了組織培養(yǎng)技術的發(fā)展。,組織培養(yǎng)中熱門的研究領域,1)細胞內部的活動，如DNA的復制和轉錄、蛋白質合成、能量代謝；2)細胞內部的流動，如RNA從細胞核向細胞質方向運轉，激素受體復合物的易位等；3)生態(tài)學，如營養(yǎng)、感染、病毒或化學誘變、藥物作用；4)細胞與細胞之間的相互作用，如胚胎誘導、細胞群體的動力學等。,組織培養(yǎng)的分類及基本概念,分類:1.組織培養(yǎng)(Tissue Cult

3、ure) 指的是從體內取出組織，在模擬體內生理環(huán)境，無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結構和功能的方法。2.細胞培養(yǎng)(Cell Culture) 培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群。3.器官培養(yǎng)（Organ Culture） 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。,組織培養(yǎng)的細胞生物學特點:,1.體內外細胞的差異：當人工條件和體內實際情況不完全相同時，細胞在體外培養(yǎng)后，一旦失

4、去神經(jīng)體液調節(jié)和細胞間相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細胞最多見的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結構和細胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細胞趨單一化、不死性、惡性狀。2.細胞增殖和分化：是細胞生命進化中所獲得的基本屬性，增殖使細胞數(shù)量增多；分化使機體結構和功能多樣化，最后演變成完整的有機體。,培養(yǎng)細胞的分化,細胞分化機制是極其復雜的，是在細胞與細胞、細胞與體液和細胞與細胞外基質相互作用下，眾多基因參

5、與、經(jīng)過多階段和多環(huán)節(jié)完成的動態(tài)演變過程。,不適應（Deadaption） 細胞在體內時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉移酶的特性。脫分化（去分化）（Dedifferentiation） 由于基因變異而使細胞失去分化能力。如肝細胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉移酶的特性后，儲存肝糖元的能力喪失，并很難再現(xiàn)。,培養(yǎng)細胞的分化,不適應和脫分化兩個概念不同：不適應

6、是因為生存條件改變而使分化發(fā)生抑制；從分子水平考慮，脫分化很可能是基因變異所致。,培養(yǎng)細胞的分化,培養(yǎng)細胞的形態(tài),1.貼附型：1）成纖維細胞：心肌細胞，血管內皮細胞等2）上皮型細胞：消化管外皮細胞，肝臟上皮細胞等3）游走型細胞：神經(jīng)膠質細胞4）多形型細胞：神經(jīng)組織細胞2.懸浮型：如癌細胞,培養(yǎng)細胞的生長和增殖,1.原代培養(yǎng)（Primary Culture）階段：或稱初代培養(yǎng)。從體內取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代，隨不同的組織時間

7、長短不一，一般為1~4w2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細胞系（Cell line）階段，細胞增殖旺盛，一般細胞可傳代10-50代）。,3.衰退階段： 自發(fā)性轉化（Spontaneous Transformation）：其標志是獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）: 細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系(Infinite cell line)或連續(xù)細胞系(

8、Continuous cell line)。 如：BHK（倉鼠腎成纖維細胞），F(xiàn)9（小鼠胚胎癌細胞），M2R（黑色素瘤細胞）等。,培養(yǎng)細胞的生長和增殖,培養(yǎng)細胞的傳代培養(yǎng),當細胞生長達到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質、接種細胞的數(shù)量和細胞增殖速度有關。所謂細胞“一代”，即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。如某一細胞系為50代即該細胞已傳代50次。,細胞傳代的三個階段,1）潛伏期（Latent pha

9、se）： 細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。二倍體細胞該期時間長（24~96h）；連續(xù)細胞系時間短（10~30min）。,2) 指數(shù)生長期（Logarthmic growth phase）： 細胞增殖最旺盛時期，一般用細胞分裂指數(shù)（Mitotic index，MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)介于0.1~0.5%，且受細胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。,細胞傳代

10、的三個階段,,指數(shù)生長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細胞標志之一。癌細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition）,3)停滯期（Stagnate phase）：

11、 即細胞數(shù)量達到飽和密度后，細胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細胞停止增殖，進入停滯期。在此時應及時進行換液傳代，否則因細胞中毒受損，大量細胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細胞才能恢復。,細胞傳代的三個階段,細胞培養(yǎng)的基本條件,1)儀器和設備:常規(guī)的細胞培養(yǎng)設備：如CO2孵箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，純水設備，干燥消毒除菌設備，清洗設備等。2)培養(yǎng)液:目前常用的基礎培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM

12、，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。,細胞培養(yǎng)的基本條件,3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。 由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實驗，如進行藥物和受體及營養(yǎng)等方面的研究時，需要使用無血清培養(yǎng)基。,細胞培養(yǎng)的基本條件,4)平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸監(jiān)度維持在培養(yǎng)細胞生理范圍內，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有P

13、BS，Hank’s等。5)抗生素:常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。,6)其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），緩沖效能(pKa)在20℃時為7.55，37℃為7.31； HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調整pH常常用NaHCO3溶液

14、。有機補充物，如丙酮酸鈉， 谷胺酰氨等。促細胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細胞的特殊要求進行添加。,細胞培養(yǎng)的基本條件,培養(yǎng)液的物理性質,pH值：大多數(shù)細胞在pH7.4時生長最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚紅是常用的指示劑，用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍紅色--pH7.6

15、，紫色--pH7.8。溫度：溫度除直接影響細胞生長外，還與培養(yǎng)液的pH值有關，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響pH。,滲透壓：培養(yǎng)液滲透壓一般介于260~320 mosm/kg之間。 人類血漿滲透壓290mosm /kg，小鼠類為310mosm /kg。粘度：由于血清的存在，直接影響培養(yǎng)液粘度。表面張力：培養(yǎng)液的表面張力有利于培養(yǎng)物粘著于底物上面。,培養(yǎng)液的物理性質,細胞培養(yǎng)的基本方法,1.組織、細胞的解離方法1.1

16、解離組織：在無菌情況下采取動物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺或無菌室內進行解離處理。解離時應注意:1) 盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈；2) 剪碎組織時，避免損傷組織塊；3) 解離組織用的各種酶系，需要先進行低速離心。,解離細胞,常用酶和鰲合劑進行解離：當實驗室需要制備具有均勻細胞層的培養(yǎng)物；從單個細胞出發(fā)獲得細胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細胞量時。,解離細胞的方法,1）胰蛋白

17、酶解離細胞法：所需時間較短，主要缺點是破損細胞。2）膠原酶解離細胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。3）機械解離細胞法：比酶法所需時間短，但細胞存活率較低。4）螯合劑解離細胞法：分離效果差,原代細胞培養(yǎng),1）外植塊培養(yǎng)：外植塊在一定限度內可保持其原有組織結構，有利于其適應體外培養(yǎng)環(huán)境。短期培養(yǎng)

18、的外植塊成為細胞培養(yǎng)的材料來源之一。2）單層細胞培養(yǎng)：每隔1~3d換液一次，細胞長成單層后傳代培養(yǎng)。,3）懸浮細胞培養(yǎng)：使細胞成懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長。由于細胞本身是不粘附的，如小鼠白血病細胞和腹水腫瘤細胞；通過機械攪動使細胞保持懸浮狀態(tài)；通過選擇培養(yǎng)得到能懸浮生長的細胞進行懸浮培養(yǎng)。,原代細胞培養(yǎng),細胞培養(yǎng)中應注意的幾個問題,1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細胞生長，不能盲目增加每單位體積的細胞

19、濃度。2）PH：初培養(yǎng)pH應為7.4，培養(yǎng)過程應不低于7.0。3）培養(yǎng)瓶內的空間：一般培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。,4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2~0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。5）去除死細胞6）溫度控制：動物細胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細胞生長緩慢；溫度高于37.5℃

20、，細胞存活力降低。,細胞培養(yǎng)中應注意的幾個問題,細胞系及其鑒定,原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細胞類型多而復雜。因此在培養(yǎng)初期，存活和生長的細胞類型也是多種多樣的。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細胞不斷地生長，而且是使培養(yǎng)物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細胞，即細胞系(Cell line)。,細胞克隆技術,培育細胞系可采用細胞克隆技術。 一個克隆的細胞群體是從一個單一母細胞繁殖而來，分離單一細胞并使其繁殖為一細胞群體的方法稱為

21、克隆化(cloning)。,細胞克隆技術的方法,1.稀釋鋪板法2.飼養(yǎng)層克隆法3.膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法4.瓊脂克隆法5.在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法,細胞系鑒定,當細胞系建立后，應對細胞系進行一系列鑒定后，才能應用于細胞生物學、免疫學、細胞遺傳學等方面的研究。鑒定內容應包括:1)細胞系的細胞來源；2)鑒定細胞系的純度，即除了主類細胞外，還雜有哪類細胞；3)細胞系的穩(wěn)定性，即在細胞連續(xù)培養(yǎng)過程中主要指標應無明顯變化

22、；4)累積細胞系的形態(tài)及其表達特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來源細胞的差異等；,細胞系鑒定指標,1.形態(tài)學：活細胞觀察；固定染色觀察培養(yǎng)細胞。2.染色體： 染色體是一種鑒定細胞系的種屬、性別來源較為確切的指標；也是檢查細胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細胞有否發(fā)生轉化的可靠指標；是區(qū)別正常細胞與惡性細胞的指標。 采用染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術檢測。,3.同工酶譜： 通常采用G6P

23、D(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據(jù)條件選擇。,細胞系鑒定指標,4.細胞DNA遺傳特征: 限制性片斷長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物進化過程中，DNA序列發(fā)生某些中性突變，突變的結果是失去或獲得一個酶切點，因此當基因組DNA用限制性內切酶酶切后，限制性內切酶片斷加長或縮短；用同源的克隆DNA為探針可

24、以探測出來。另外也可能在生物進化過程中DNA分子結構發(fā)生重排，使DNA堿基排列序列改變，影響內切酶切點,使內切酶酶切片斷呈多態(tài)性。 一般采用Southern印跡雜交法檢測。,細胞系鑒定指標,培養(yǎng)細胞的污染問題及檢測,細胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。,細胞污染的種類和判定,細胞培養(yǎng)中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以

25、下情況時培養(yǎng)的細胞可能有污染：1) 培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。2)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。4)細胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。,污染物的檢測,1.細菌和真菌污染的檢測：1）涂片染色鏡檢；2）接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細菌檢測；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營養(yǎng)肉湯適于檢測真菌。 檢測到陽性結果后，應高壓滅菌處理污染

26、的培養(yǎng)物及其用具。,,2.支原體檢測: 支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾病毒的復制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。,污染物的檢測,支原體檢測方法和處理,1）熒光技術檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結合，可根據(jù)細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)

27、法：實驗室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交： 檢測完畢后，所有實驗用具均應經(jīng)過高壓消毒處理。,5）污染支原體后的處理： 抗生素處理：如加入泰樂菌素等。 共培養(yǎng)法：與巨噬細胞共培養(yǎng)。 重新克隆法：抗生素處理后，將細胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4~5周后，重復克隆2次。 過濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過濾。,支原體檢測方法和處理,污染病毒的檢測,1）致細胞病變效應（CPE）

28、或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測2）血細胞吸附試驗；3）雞胚接種。,細胞間交叉污染,為避免細胞間交叉污染，應注意：了解各細胞系的特征；培養(yǎng)各細胞系的操作手續(xù)要快速；培養(yǎng)各細胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；吸過培養(yǎng)液和細胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的瓶內；經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。,在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進行冷凍保存，在需要時再復溫融解進行體

29、外培養(yǎng)（復蘇）。要獲得好的凍存與復蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復溫速率、冷凍保護劑，冷凍保存溫度。,細胞保存,1、 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，是活細胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。 不同細胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞最適冷凍速度分別是1.6℃、7℃和200/分。所

30、以一種細胞冷凍保存之前要測試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。,細胞保存,2、復溫速率 復溫速率是指細胞復蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細胞復蘇時，復溫速率不當也會降低冷凍存活率。一般來說復溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內要完成復溫。,細胞保存,3、冷凍保護劑 冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質，常被加到一定的溶液中進行配制，作為冷凍保護液。紅細胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳類動物細胞懸浮在

31、水或簡單的鹽溶液中而不加冷凍保護劑，以最適的冷凍速率冷凍保存可獲得活的凍存物。,細胞保存,對大多數(shù)有核哺乳類動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。 目前冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子的物質，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要有聚乙烯吡咯烷酮（P