1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文Ad.FnCBD轉(zhuǎn)染人內(nèi)皮祖細(xì)胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究姓名：侯廣杰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（胸心外科）指導(dǎo)教師：徐志云20060508第= 軍黻^ 掌博士球l 位論文蝴r 善·底疆K 翻嗡轉(zhuǎn)染入疼蝴艟梅崩碰瓣溯燃漿實(shí)騷蛹碧怒【j 商要1 目的t 通避轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞( E P c s ) 的粘附力，并在生物反應(yīng)器 交整體擒建縫織王程；§黲瓣貘( 麟) 。方法；逶過(guò)瓣c

2、o l l 密霾攆疫褰心款久雷懿檬本中獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞( B M N C s ) ，差異貼蹩法從中分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)膩( E P c s ) 。采用■P L S 搏動(dòng)泵作為脈動(dòng)流場(chǎng)動(dòng)力源并改進(jìn)氣液交換通路構(gòu)建新的生物反應(yīng)器。構(gòu)建攜繁F N 信號(hào)肢序列的黧組腺病毒A d 。F n C B 玩4 ，分別采靂w ；s t e 糟- b l o t 幫E H s A 法撿灝轉(zhuǎn)染緇胞蕊F n C B 玩的表達(dá)和分泌。鹼測(cè)艋．孫C B D 6 4

3、轉(zhuǎn)染E P e s 后對(duì)細(xì)瑰粘辯力影響，并在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行吖淵[ v 培養(yǎng)的初步研究。結(jié)果：E P c s 體外培養(yǎng)增殖快速，可定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞；構(gòu)建的生物反威器可以產(chǎn)生o - 6 0 0 0 m l ／m i n 的脈動(dòng)流量，薺瀵怒湊莽髓鞭v 靛要求；橡建的繁畜硪德號(hào)獲彥翔漿重縫躲瘸毒鰣。歉c B 域4 轉(zhuǎn)染E p c s 后，細(xì)胞能高效表達(dá)和分泌F n c B D 6 4 且細(xì)胞粘附速度和粘附數(shù)量均顯著高于對(duì)照組( P <

4、 0 ．0 5 ) 。整體構(gòu)建的他H v 的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)生物反應(yīng)器內(nèi)7 d 小流量脈動(dòng)滾場(chǎng)( o - 6 ∞m l ／戚n ) 懿蜷棼，A d 。淼C B ‰轉(zhuǎn)祭組懿聰| 董v 鴦?shì)^多纓瞧存黧；但在大流量流場(chǎng)( O 一4 8 ∞m l ，m i n ) 培養(yǎng)中，1 琶壬{ V 的細(xì)胞無(wú)存留。結(jié)論： E P C s 怒一種較為理想的T E H v 種子細(xì)胞來(lái)源；攜帶信號(hào)肽序列的A d ．F n c B D 6 4 轉(zhuǎn)染E P c s 可有

5、效提高細(xì)胞的粘附力，有助于嘲v 的構(gòu)建，但目秘方法構(gòu)建的髓! H v 逐不能耐受大流量濾蔣的滓裁，泰采程} Ⅳ熬研究還裔壤多潤(rùn)蹙鬻要簿決。關(guān)鍵詞組織工穰，心臟瓣膜，內(nèi)皮粗細(xì)胞，熬因轉(zhuǎn)染，生物反應(yīng)器，信號(hào)肽，纖維逡接蛋白羧基端細(xì)胞結(jié)合域S m d i e so n t i s 蝴e e I 堇g i 堇l e e f i n gh e 甜t v a ～e c o n s t n l c ￡i o nw i t h 瓤l l m a n e

6、 n d o t 玨e i i a lp r o g e n i t o fc e l l st r a n s f e c t e d b y A d ．F n C B D 甜鏨確毹糯c 餐0 撼e c l 和e ：孫p 薹。m o t e8 魏c s 氧攘疆強(qiáng)d o 壕e l 斌即辨玨蛔r ∞l l s 零P c ◇約d e c e n u l a f i z e dp o r c 童n ea o n i c v a l v es

7、c 橢e u s i n 鷺躺n et 砌s f e 商o nt e c h n i q u e 孤dt 0o p t i m i z cT E H V c o 州n m c t i o ni n D u l s a t i l eb i o r e a c t o L M e t h o d s ：I s o l 8 t c d a n dc u l t u r e dh u m 姐E P C sf 嘞nb I 嘲e m a r r

8、o w s a m p l ew i t h F i c o l l 宴靼d i e n tc e n t f i 瓤毖a(bǔ) t i o n a n dd i 囂e f c n 娃越a d h e s 三0 戴e 玨l №辯耋ns e q 辯n c ‰m e a n w h i 薹e ，h i l ta 赫e w 翻l s 箍主i 耋eb i o f e a c 耄o r 硒疆蚤P L S 辨m ps 強(qiáng)耙瞰鋤d am o d i f i

9、 e d a i r _ l i q u i d e x c h a n g e p a s s a 霉e ．下l 他n c o n s t m c t e d ar c p l i c a t i o n ·d e f i c i e n tr c c o m b i n a n ta d c n o v i n l sc o d i n gF ns i 麟a lp e p t i 如粕dF n C B D 6 4 ，柚d

10、v e r i f i e d m a t t h ev i n l s∞玨l de ：f 至莖d e n l l ￥馘p 稽醛秘ds e 澎￡翔C B 璐臻群c e l ll 粼s 觸l 豫鞋s 紐窶w e s 差e 黼一糙o | 勰纛E U S A t e c h n i q u e ．A f t e I m 姑e v a l u a t e dl h e e 摜c c t o fE P C sa d h e s i o n a f

11、 t e rA d ．F n C B D 6 4t r a n s f e c t i o n ，a n dd i ds o m ep r i m a r ys t u d Vo nT E l Ⅳc u l t u r ci n t h en 尊w l yb u i l tb i o r e a c t O 六l k s u l l s ：E P C si s 毯珊vp 塒l i f e f a t i v ea 玨d 主td i f

12、f i 糨l t { a ￡e si n l oe n d o 撮e l i a l 耐l s 跏確拋。1 弧尊b i 搦℃瓣￡o f 甄l i l t ∞玨l d 疊c n e r a t e d 參㈣m 鼬血p u l 鼢童主l e 積O w a n dc 0 疆l d s 玨p ∞n 強(qiáng)} 薹Vc u l t u r e i n v i t r o ．W h e nt r 蹦s f c c t e db yA d ．F n C B

13、 n 6 4 ，E P C se f f i c i e n t l Ve x p r e s s a n d ∞c r e t eF h C B l ) 酣，a n dt h a t r e s u l t i n 1 1 i 曲e f a d h e s i o n s p e e d a n d s t m n g c ra d I l l e s i o n s t r e n # 曲i 堇l扛臻s 螢瞅醛耋P e s 氌鰱攮e

14、 ∞玨l ∞l 舯鞋pc e l 滾p 鋤。涎≥。W 纛強(qiáng)e x 娜撼撼羹堪賦l l e 基鰳r 弧b i o f e a c t o r ’l n o r eA d ．F n C B D 6 4 t r a n s f c 鼬棚E P C s r c m a i n e d 脅“mi n l o w ．n o w ( o - 6 0 0 m l ，m i n )h y d l - o d v n a m i c s a n da l

15、m o s t n o c e l l r e I n a i l l e d i n h i g I l —f l o w ( m 4 8 ( K ) n l l ／m i l l ) e I l v j r o 砌e n t ．C O n C l u 蛹O n s ：E P c si s l h e b e l l e f c h o { c e o f s e e d c e l l 婦強(qiáng)烈V ∞n s t f l l c l i

16、 o 玨巍娃A d ．F n C B D 甜l f a n s 敝溺o ne 攢d e n t 耋Vp 瓣燃o(jì) t ea 蕊e s i o n 《鞘e so nd e c e l l u 重a f 主z c dx e n O 罩a f ta o n i c v a l v e s ．S t i l l ，m u c h w o r k i sn e e d e d i nt h e f l l t u r es t u d v 0 fT

17、 E H VK e y w o r d s ：t i s s l l e e n g i n e e r i n 島h e a r t V a l v e ，e n d o t h e l i a lp r o 學(xué)n i t o f ∞l l ，g c n et f a n s f e c t i o n 'b i 疆e 毪c l o 毛s i 鼬a lp e 皤d e ，鐨國(guó)o x ￥一l 囂m 主玨蠢c e l } b ；藏