1、硫化物與地球上生命的出現(xiàn)有著千絲萬縷的聯(lián)系，硫化物與酸性含鐵的水相互作用促進了膠體性鐵硫蛋白膜的出現(xiàn)，被認為大大提高了第一個有機物合成事件的頻率。從許多古代化石中可以發(fā)現(xiàn)，有許多化能自養(yǎng)的生物是以硫化合物為基礎能源生活的，直到現(xiàn)在，硫化物繼續(xù)影響著許多生物的生長，而且硫在微生物生物質中是第6大豐富的元素，因此硫和硫化物的代謝對于地球化學循環(huán)至關重要。
　　環(huán)境中H2S主要是由硫酸鹽還原作用，火山作用等產生，在生物體內也產生，主要來

2、源于氨基酸的代謝。由各種方式產生的H2S還可以釋放到環(huán)境中，而且海洋中也會產生許多含硫化合物，例如氣態(tài)的H2S和SO2等都會釋放到空氣中。多余的H2S會污染空氣，SO2會造成酸雨等眾多環(huán)境質量問題。一般H2S的去除是氧化到硫酸鹽，之后被植物利用，從而完成硫循環(huán)的關鍵步驟，而自然界中H2S的氧化主要是靠微生物的作用，尤其是一些硫氧化細菌和古生菌。
　　H2S的毒性與其濃度密切相關，在高濃度時會對生物產生神經性的毒性，而在低濃度時可以

3、起到重要的生理功能，如在哺乳動物中，高濃度的H2S會導致中毒，但低濃度H2S則可以調節(jié)各種生理功能等，由此H2S被認為是繼NO和CO后的第三種氣體信號分子。
　　維持H2S的濃度對于生物來說至關重要，生物中過多的H2S主要是通過酶的聯(lián)合作用發(fā)生氧化而去除的。在哺乳動物線粒體中包含了一套重要的酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)由硫醌氧化還原酶(SQR)，過硫化物雙加氧酶(PDO)和硫轉移酶(ST)組成，這3個酶進行聯(lián)合作用，將H2S代謝為硫代硫酸鹽，該

4、系統(tǒng)的代謝路線已經被報道，但對于H2S的氧化途徑仍存在著一些不清楚的問題。這些問題主要集中在(1)硫醌氧化還原酶氧化H2S的產物—硫烷硫，具體是什么形式的？在真核生物線粒體中SQR的活性需要有硫烷的受體，是否在所有的生物中都需要？如果需要，受體是什么？現(xiàn)有的報道認為谷胱甘肽，半胱氨酸，亞硫酸鹽都可能作為受體，但真正的生理受體并不清楚;(2)SQR/PDO/ST這套系統(tǒng)在異養(yǎng)細菌中是否存在？如果存在，其作用是否和真核生物中相似？(3)在異

5、養(yǎng)細菌中是否存在與真核生物不同的還原性無機硫化合物的代謝途徑？其生理意義是什么？(4)在微生物中的研究大多都集中在自養(yǎng)型細菌中，在異養(yǎng)細菌中的研究較少，但是由于異養(yǎng)細菌廣泛的分布、數量的優(yōu)勢以及生長繁殖的快速等優(yōu)勢，使得它代謝H2S的速率可能更快，這可能具有重要的生態(tài)學意義。
　　為了解決以上提出的問題，本文重點放在異養(yǎng)細菌H2S的生物氧化上，以大腸桿菌作為載體研究了SQR/PDO/ST系統(tǒng)的酶學、氧化H2S的能力、途徑以及產物等

6、，或直接在野生菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中研究代謝H2S的情況。具體研究了以下內容;
　　(1)利用已經發(fā)現(xiàn)的過硫化物雙加氧酶(PDO)基因作為查詢序列，通過BLAST程序，在已經測序的細菌基因組中，尋找是否有存在于細菌中的過硫化物雙加氧酶。結果發(fā)現(xiàn)該酶的同源蛋白質廣泛存在于細菌中，并主要集中在變形菌門和藍細菌門，約占已經測序細菌基因組總量的20％;根據多序列比對，將新發(fā)現(xiàn)的與已經報道的蛋

7、白質進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，以此將可能的過硫化物雙加氧酶分為3類;PDO1，PDO2和Blh，并且這3類與GloB1和GloB2的親緣關系較近，后兩者都是乙二醛酶。已經報道的MxPDO1和PpPDO2的結構解析顯示PDO1和PDO2在底物結合位點上的區(qū)別，從而說明了本文對于PDO的分類的準確性。從這3類PDO以及GloB1和GloB2中共挑取了14個蛋白質，利用GSSH作為底物對其酶活性進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)有8個酶具有過硫化物雙加氧酶活性，

8、分別屬于PDO1，PDO2和Blh這三類，其中以MxPDO1a催化效率最高，在GloB1和GloB2中選擇的蛋白質均沒有活性，與我們用進化樹進行預測的結果相吻合。通過ICP-MS檢測了CpPDO2等酶的重金屬組成，發(fā)現(xiàn)它含有與蛋白濃度等量的Fe2+，并利用透析實驗和金屬離子孵育的方法進一步確認了PDO需要Fe2+作為輔因子，一部分PDO中可以用Mn2+取代Fe2+，這與過硫化物雙加氧酶屬于MBL(metallo-β-lactamase)

9、家族的特征相符合。根據序列相似性，利用BLASTP程序尋找了在革蘭氏陽性細菌中的可能的硫加氧酶，將這3個可能的硫加氧酶基因與已知活性的CpSQR的基因連接在一起，并克隆至pBBR1MCS2質粒上，再轉化入E.coli BL21(DE3)，分析了該菌株的活性，發(fā)現(xiàn)異源表達的菌株能夠快速的代謝H2S，說明這些陽性菌中可能的硫雙加氧酶具有氧化硫烷（由CpSQR代謝H2S產生）的能力，但無法確定其是否以GSSH作為底物。將PaPDO2在其野生菌

10、株Pseudomonas aeruginosa PAO1敲除后發(fā)現(xiàn)突變株△PaPDO2積累了更多的H2S，這說明PDO在細菌H2S的氧化中起到重要的生理功能。
　　(2)將Cupriavidus pinatubonensis JMP134中的2個酶，CpSQR和CpPDO2克隆至大腸桿菌中，進行異源表達，研究它們代謝H2S的途徑。由于CpSQR中包含2個結構域，HcaD和DUF442，其中根據已經報道的文獻知道HcaD是一個硫醌氧

11、化還原酶，而DUF442則是一個可能的硫轉移酶。結果發(fā)現(xiàn)CpSQR代謝H2S的產物主要是二硫化物和三硫化物，這與真核生物中不同;另外，發(fā)現(xiàn)并證明了CpDUF442是一個具有硫轉移酶功能的結構域，它在3個酶催化H2S的反應中起到的作用都與在真核生物中的硫轉移酶不同，其中一個新功能是它促進SQR產物多硫化物和GSH的反應速度，這暗示著CpDUF442在促進硫烷轉移速率上發(fā)揮了重要的作用;另外，CpDUF442還催化GSSH和SO32-的反應

12、，這與真核生物中報道的一致。發(fā)現(xiàn)了多硫化物和GSH或亞硫酸鹽可以自發(fā)反應，并通過光譜學方法計算了它們的自發(fā)反應速率，分別是8.4±0.7μM min-1和6.3±0.5μM min-1，當加入CpDUF442時，前者的反應速度增加為13.3±1.2μM min-1，而后者則沒有明顯變化。生化實驗和體內分析數據都表明，CpDUF442不能以硫代硫酸鹽作為底物，這與人和酵母線粒體中硫轉移酶能轉移硫代硫酸鹽和GSH反應生成GSSH和亞硫酸鹽的

13、結論不一致。本文還對異源表達菌株代謝H2S和多硫化物的途徑進行了闡述，研究了它們的代謝產物，并利用代謝產物進行了流量平衡分析;CpSQR和CpPDO2代謝H2S的產物為亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的混合物，有少量的硫烷累積，從流量平衡分析來看，CpDUF442催化GSSH和SO32-的功能在該系統(tǒng)中的作用并不明顯，硫轉移酶在代謝H2S過程中所起的作用可能主要是促進硫烷硫的分配，例如多硫化物和GSH的反應。最后，根據流量平衡分析提出了H2S在大腸

14、桿菌中氧化途徑的模型。
　　(3)在Cupriavidus pinatubonensis JMP134中，利用已經測序的基因組數據，對其硫化合物代謝相關的基因進行了系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)它具有多個和硫化合物氧化相關的系統(tǒng)，分別是SQR/PDO/ST系統(tǒng)，SOX系統(tǒng)，SO系統(tǒng)以及FCSD系統(tǒng)等，利用無痕敲除對這些系統(tǒng)的關鍵基因進行了單敲除或多敲除，并利用野生菌和敲除菌株的全細胞分析了代謝H2S，SO32-或S2O32-的產物。分析結果發(fā)現(xiàn)

15、，負責H2S氧化的主要是SQR/PDO/ST系統(tǒng)，SOX系統(tǒng)可能在SQR功能失活后起到互補的功能，也可能是互補SQR的功能，但是效率不高;在野生菌中SQR/PDO/ST系統(tǒng)代謝H2S時可檢測到的產物只有S2O32-，這與利用大腸桿菌異源表達SQR/PDO/ST氧化H2S時的產物（SO32-和S2O32-的混合物）不同，分析與PDO的活性有關系，代謝產物是否具有SO32-仍需要進一步實驗;負責外源的SO32-氧化的主要是SO系統(tǒng)，即Sor

16、AB，產物為硫酸鹽，并且亞硫酸鹽消耗和硫酸鹽生成接近1∶1，SOX系統(tǒng)（包括SoxCD）并不能起到氧化外源亞硫酸鹽的作用;同樣，負責內源和外源S2O32-氧化的系統(tǒng)主要是SOX系統(tǒng)，氧化產物為硫酸鹽，每分子硫代硫酸鹽生成約2分子硫酸鹽，SoxF（即FCSD）可能作為SOX的一個重要部分參與其氧化硫代硫酸鹽和H2S，但是單獨作用并沒有氧化H2S的功能。亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽的氧化途徑均符合質量守恒定律，這樣在細胞中不會過多地積累這一類硫化合

17、物，均以硫酸鹽的形式排放到環(huán)境中。根據基因組分析和全細胞分析的結果，還提出了在異養(yǎng)細菌C.pinatubonensis JMP134中的硫化合物的代謝模型，該模型包括了從硫酸鹽的同化作用開始，到細胞內H2S的產生，以及H2S主要由SQR/PDO/ST系統(tǒng)氧化的過程，產物可能主要是S2O32-，以及S2O32-與SO32-在周質空間內依賴于SOX或SO系統(tǒng)的氧化情況等，還對于胞內的S2O32-與SO32-之間的轉化及其與硫烷庫和硫轉移酶的