1、中文 中文 3800 字文獻出處： 文獻出處：Kizaki N, Yasohara Y, Hasegawa J, et al. Synthesis of optically pure ethyl ( S )-4-chloro-3-hydroxybutanoate by, Escherichia coli, transformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose

2、 dehydrogenase genes[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2001, 55(5):590.由共表達碳酰 碳酰還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌轉化細胞合成純光學（ 合成純光學（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯Kizaki N, Yasohara Y, Hasegawa J, et al.1.摘要 摘要本本篇文獻研究了利用 COBE 不對稱合成（S）-4-氯-3-羥基丁

3、酸乙酯（CHBE） 。大腸桿菌細胞作為催化劑同時表達了來自念珠菌屬辛夷的碳酰還原酶和來自巨大芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因。在水/有機溶劑兩相體系中，(S)-CHBE 在有機相中的濃度可以達到2.58M（430g/l） ，摩爾產率達到 85%。大腸桿菌的副產物 S1 和 GDH 也達到了 1.25M（208g/l） ，COBE 在水相中不穩(wěn)定，所以(S)-CHBE 可以在水單相中不停的生成。在這種情況下，適當?shù)膹?NADP++到 CHBE

4、的轉變達到了 21,600 mol/mol。所形成的 CHBE 的旋光度在這種體系中 100%對映體過量。在水相中用攜帶含有 S1 和 GDH 基因質粒的 E. coli HB101 作為催化劑不對稱還原是比較簡單的。并且，這種體系并不額外需要商業(yè) GDH 或者有機溶劑。因此，這種體系對于實際合成純光學活性的(S)-CHBE 是非常方便的。介紹具有旋光性的（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯在藥物制劑的合成中是重要的手性化合物。其右旋體是

5、 L-卡尼汀的前體，其左旋體是羥甲基戊二酰輔酶 A 還原酶抑制劑的起始材料。許多研究描述了以面包酵母為基礎微生物或者酶的 COBE 的不對稱還原。我們先前已經知道利用來自念珠菌屬辛夷 AKU4643 細胞催化 COBE 生成光學純度 96%的 CHBE。這種酵母至少有三種立體選擇性的還原酶，這種酵母產生的 CHBE 并非純光學的，在這三種酶之中，NADPH-依賴碳酰還原酶，我們克隆并測序編碼 S1 的基因，并在大腸桿菌中過表達。大腸桿菌

6、轉化細胞在葡萄糖，NADP+和商業(yè)化的葡萄糖脫氫酶作為輔酶因子的啟動子催化COBE 生成純光學的 CHBE。我們構建這三種大腸桿菌轉化細胞共表達來自的 S1 和來自巨大芽孢桿菌的 GDH，并插入到 pSTV28 質粒的 EcoRI-PstI 的酶切位點。pSTVG 質粒被導入到 E. coli HB101。2.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基和培菌 和培菌2*YT 培養(yǎng)基 包含有 1.6%細菌用胰蛋白胨，1.0%酵母提取物，0.5% NaCl，pH7

7、.0.攜帶有 pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1 的大腸桿菌 HB101 被接種到有 0.1mg/ml 氨芐青霉素的 2ml 的 2*YT 培養(yǎng)基，37°C 搖床 15 小時。將 0.5ml 菌液接種到 100ml2*YT 培養(yǎng)基的 500ml 燒瓶中。在 37°C 搖床培養(yǎng) 13 小時。攜帶有 pNTS1 和 pSTVG 質粒的大腸桿菌 HB101 在 2*YT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)方法相似，只是培養(yǎng)

8、基中要加入 0.1 mg/ml 的氨芐青霉素和 0.1 mg/ml 的氯霉素。2.3 無細胞 無細胞抽提 抽提液和酶鑒定 液和酶鑒定將 100ml 培養(yǎng)液離心收獲菌體，用 50ml0.1mol/LpH 為 6.5 的磷酸緩沖液懸浮，然后超聲粉碎。細胞碎片通過離心可以去除，收集上層清液就是無細胞抽提物。碳酰還原酶 S1的活性由分光光度計測量如下：測定的混合物包括：0.1mol/LpH6.5 的磷酸二氫鉀緩沖液，0.1mMNADPH 和 1

9、mMCOBE。反應在 30°C 條件下反應，并且隨時監(jiān)測其在 340nm 處的吸光值。測 GDH 混合物包括：1M pH 8.0 的 Tris-HCl 的緩沖液，100mM 的葡萄糖，2mM 的NADP+。反應在 25°C 下進行，監(jiān)測其在 340nm 處的吸光值。一個單位 S1 或 GDH 被定義為每分鐘催化還原 1μmol NADP+或氧化 1 μmol NADPH 的量。蛋白質的測定通過含有考馬斯亮藍的蛋白質測

10、定試劑利用牛血清白蛋白作為標準進行測定。2.4 酶穩(wěn)定性的研究 酶穩(wěn)定性的研究一毫升含有含有 pNTS1 質粒的 E. coli HB101 的無細胞抽提液的 100mM 磷酸氫二鉀緩沖液（pH6.5）與等體積的有機溶劑混合。混合物在 30 °C 震搖 48 小時后，水相中殘留的酶活力即是上述的酶活力。2.5 表達 表達 S1 基因和 基因和 GDH 基因的大腸桿菌細胞在兩相反應體系中的 基因的大腸桿菌細胞在兩相反應體系中的還