1、肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，發(fā)揮著諸多重要功能，如代謝、合成、免疫和解毒等。肝組織工程，由來自兩個(gè)方面的需求驅(qū)動(dòng)，在過去的三十年間經(jīng)歷了快速發(fā)展。第一個(gè)方面來自臨床上肝臟移植。肝移植是治療終末期肝衰竭等肝臟疾病的唯一的有效手段。然而，肝移植治療手段受制于肝供體的短缺、移植后的免疫排斥和移植耗費(fèi)巨大等問題。這些情況使得體外構(gòu)建功能性肝組織移植體尤為重要。另一方面，當(dāng)前藥物開發(fā)過程中，藥物誘導(dǎo)肝損傷是難以預(yù)料的不良反應(yīng)，導(dǎo)致藥物開發(fā)效率低下、

2、成本提升。當(dāng)前，醫(yī)藥企業(yè)依賴于二維肝細(xì)胞培養(yǎng)模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行體外和體內(nèi)藥物分析。然而，二維細(xì)胞模型難以再現(xiàn)體內(nèi)肝臟的三維生理微環(huán)境;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有工作繁重、耗費(fèi)巨大、動(dòng)物福利等問題，且與人體在代謝通路上存在物種差異，獲得的結(jié)果無法推廣到人體試驗(yàn)中。因此，醫(yī)藥企業(yè)也迫切尋求優(yōu)勢的體外肝臟模型進(jìn)行藥物肝毒性的臨床前預(yù)篩選，加快藥物篩選進(jìn)程和提高藥物篩選效率。為了滿足上述需求，本研究提出并驗(yàn)證了兩種基于微流控芯片技術(shù)的策略，實(shí)現(xiàn)了肝組

3、織體外工程化構(gòu)筑。簡言之:策略一構(gòu)建了肝小葉樣肝臟芯片，并將其應(yīng)用于藥物肝毒性和藥物-藥物相互作用誘導(dǎo)的不良反應(yīng)分析;策略二研發(fā)了氣動(dòng)輔助微模塑方法，實(shí)現(xiàn)了肝小葉樣載細(xì)胞微凝膠的制備。本研究的完成為體外藥物肝毒性分析提供了模型支持，同時(shí)也為多尺度的肝組織工程技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路。
　　本論文所得到的研究結(jié)果如下:
　　1.本研究利用AutoCAD軟件設(shè)計(jì)了一種模擬肝小葉的多層微流控芯片，并結(jié)合光刻技術(shù)和多層軟蝕刻技術(shù)制備

4、了符合設(shè)計(jì)的仿生微流控芯片。自上而下觀察，該芯片具有四層結(jié)構(gòu)，分別為流動(dòng)層、控制層、支持層和載玻片層。其中，流動(dòng)層具有細(xì)胞培養(yǎng)微腔室，腔室內(nèi)分布有多重微柱陣列;控制層集成有氣動(dòng)控制系統(tǒng)，用于實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共定位和區(qū)域化接種。通過對(duì)芯片加工過程中流動(dòng)層與控制層的鍵合時(shí)間的探索，本研究制備出了具有結(jié)構(gòu)完整、性能良好、層與層之間緊密粘合的集成仿生微流控芯片。不同壓力驅(qū)動(dòng)試驗(yàn)顯示18psi可以實(shí)現(xiàn)氣動(dòng)控制系統(tǒng)的成功運(yùn)行，為后續(xù)構(gòu)建肝小葉

5、樣肝臟芯片提供了關(guān)鍵參數(shù)。
　　2.本研究通過順序灌注肝細(xì)胞(HepG2)和內(nèi)皮細(xì)胞(Human Aortic Endothelial Cells，HAECs)及程序化操作氣動(dòng)控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了肝臟芯片的成功構(gòu)建。共聚焦圖像顯示，本研究所構(gòu)建的肝臟芯片具有肝小葉樣的組織形態(tài)，即HepG2細(xì)胞形成的肝細(xì)胞索樣結(jié)構(gòu)和HAEC細(xì)胞形成的肝血竇樣結(jié)構(gòu)。肝代謝酶活力分析顯示，肝小葉樣肝臟芯片具有較高的基礎(chǔ)CYP-1A1/2和UGT酶活力，同時(shí)動(dòng)

6、態(tài)應(yīng)答于CYP-1A1/2和UGT酶的誘導(dǎo)劑和抑制劑。藥物毒性測試結(jié)果顯示，肝小葉樣肝臟芯片較好地響應(yīng)于不同藥物誘導(dǎo)的肝毒性，提示該芯片具有較高的藥物代謝能力。
　　3.應(yīng)用肝小葉樣肝臟芯片，本研究成功地分析了由不同藥物組合間的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝毒性。預(yù)先使用可誘導(dǎo)或抑制CYP-1A1/2和UGT酶活力的藥物處理肝臟芯片，之后使用另一種藥物再次處理，結(jié)果顯示后施加藥物的肝毒性受到了前施加藥物的影響。這些結(jié)果提示肝小葉樣肝臟芯片可

7、以為臨床前的藥物不良反應(yīng)分析提供體外肝組織模型。
　　4.作為本論文的另一部分，本研究提出了一種新型的載細(xì)胞微凝膠的制備方法，稱作氣動(dòng)輔助微模塑(Pneumatic-aided micro-molding，PAM)。氣動(dòng)輔助微模塑利用微流控芯片中預(yù)先設(shè)計(jì)的微閥門實(shí)現(xiàn)限制區(qū)域內(nèi)的凝膠固化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)載細(xì)胞凝膠的可控制備。應(yīng)用該方法，本研究實(shí)現(xiàn)了具有多種幾何形狀（三角形、正方形和圓形）的、包裹不同細(xì)胞類型（HepG2細(xì)胞、NIH3T3成

8、纖維細(xì)胞和A549細(xì)胞）的、不同凝膠種類（膠原、明膠和瓊脂）的微凝膠的可控制備。本研究通過調(diào)整微閥門的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了微凝膠中單個(gè)或多個(gè)特定形狀微通道的整合以及多個(gè)微通道的特定布局。此外，使用微閥門系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)兩步氣動(dòng)輔助微模塑過程，本研究也成功地制備了包裹不同細(xì)胞種類的多組分或多區(qū)隔化的微凝膠。
　　5.本研究構(gòu)建了集成有氣動(dòng)輔助微模塑功能的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了肝小葉樣載細(xì)胞微凝膠的制備。形態(tài)學(xué)觀察顯示，載細(xì)胞微凝膠呈現(xiàn)出肝小葉樣的組