1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在中國(guó)、朝鮮、日本等海域均有分布，我國(guó)黃渤海及東海分布尤為廣泛。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，累代養(yǎng)殖造成種質(zhì)退化，病害問(wèn)題也日趨嚴(yán)重，給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。其中，白斑綜合征病毒(WSSV)以及弧菌等病原均會(huì)造成三疣梭子蟹組織病變乃至死亡。此外，作為一種重要的水體環(huán)境因子，鹽度也會(huì)對(duì)三疣梭子蟹等甲殼動(dòng)物的免疫能力產(chǎn)生較大影響。三疣梭子蟹等無(wú)脊

2、椎動(dòng)物不具有獲得性免疫，但可以依賴機(jī)體自身獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng)，通過(guò)一系列免疫信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抵御入侵機(jī)體的病原微生物。有鑒于此，本研究利用溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行感染并取其血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出免疫相關(guān)基因；以副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和WSSV作為病原對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染，并通過(guò)低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，對(duì)三疣梭子蟹先天免疫相關(guān)基因的功能進(jìn)行初步研究，為深入開

3、展三疣梭子蟹等甲殼動(dòng)物病害防御機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為有效解決養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中出現(xiàn)的病害問(wèn)題提供理論支持。本論文的主要內(nèi)容如下：
　　1.三疣梭子蟹感染溶藻弧菌轉(zhuǎn)錄組分析及免疫基因發(fā)掘
　　溶藻弧菌作為三疣梭子蟹易感弧菌之一，會(huì)在宿主體內(nèi)增殖，造成機(jī)體細(xì)胞和組織損傷，引發(fā)“乳化病”等病害，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而三疣梭子蟹等甲殼動(dòng)物具有獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng)，可以有效抵御、清除外來(lái)病原。本研究取三疣梭子蟹感染溶藻弧菌12 h血細(xì)胞和對(duì)照組

4、血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)Trinity拼接共獲得75576條Unigene序列，其中63515條Unigenes得到注釋。GO功能注釋結(jié)果表明，共有14848條unigenes被分類到生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別中，其中生物過(guò)程主要涉及生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過(guò)程、單生物進(jìn)程、代謝過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)和免疫防御等。共有7130條unigenes被分類到KEGG代謝通路的5個(gè)分支，主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯、運(yùn)輸、分解代謝、免疫系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)通路。通

5、過(guò)比較感染組和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，共篩選出791個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的有453個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有338個(gè)。通過(guò)對(duì)GO、KEGG富集和差異基因的分析，確定Toll樣受體基因和HMGB家族基因作為本次研究的免疫基因。此外，利用溶藻弧菌感染三疣梭子蟹并進(jìn)行高通量測(cè)序，有助于進(jìn)一步探索其致病機(jī)理，并為三疣梭子蟹疾病防御及組學(xué)分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　2.三疣梭子蟹Toll家族基因的克隆與表達(dá)分析
　　三疣梭子蟹等無(wú)脊椎動(dòng)物先天

6、免疫主要是由胚系基因所編碼的模式識(shí)別受體所介導(dǎo)，Toll樣受體便是一種重要的模式識(shí)別受體。本研究采用 RACE技術(shù)克隆得到了三疣梭子蟹Toll樣受體家族中的2個(gè)新基因，分別命名為PtToll4和PtToll5。其中，PtToll4基因cDNA全長(zhǎng)4276 bp，包含2685 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)含有895個(gè)氨基酸，分子量102.5 kD，理論等電點(diǎn)6.03的蛋白質(zhì)；PtToll5基因cDNA全長(zhǎng)4914 bp，包含408

7、3 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)含有1361個(gè)氨基酸，分子量151.6 kD，理論等電點(diǎn)5.69的蛋白質(zhì)。PtToll4、PtToll5蛋白均具有典型的Toll家族結(jié)構(gòu)域，是I型跨膜蛋白，存在胞外LRR結(jié)構(gòu)域(其中PtToll4包含LRRCT結(jié)構(gòu)，PtToll5包含LRRNT結(jié)構(gòu))及保守的胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域。同源分析表明PtToll4氨基酸序列與中華絨螯蟹EsToll2的同源性最高，為61％；PtToll5氨基酸序列與羅氏沼蝦M

8、rToll的同源性最高，為75%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，PtToll4基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高，在肝胰腺中的表達(dá)量最低，而PtToll5在眼柄中的表達(dá)量最高，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最低。利用副溶血弧菌和WSSV對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染，結(jié)果表明，經(jīng)WSSV感染后PtToll4基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量顯著提高，在6 h時(shí)出現(xiàn)峰值，為對(duì)照組的5.03倍(P＜0.01)。經(jīng)副溶血弧菌感染后PtToll4基因僅在48 h略微出現(xiàn)上調(diào)，其余時(shí)間

9、點(diǎn)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。經(jīng)WSSV感染后，PtToll5基因在血細(xì)胞中出現(xiàn)了整體的表達(dá)下調(diào)，48 h達(dá)到了表達(dá)量的最低值，為對(duì)照組的0.27倍(P＜0.05)。經(jīng)WSSV感染后，PtToll5基因在血細(xì)胞中同樣出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，48 h出現(xiàn)了表達(dá)量的最低值，為對(duì)照組的0.53倍(P＜0.05)。由此我們推測(cè)PtToll4基因在三疣梭子蟹應(yīng)答WSSV的免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要功能，而PtToll5的下調(diào)表達(dá)可能也會(huì)造成三疣梭子蟹免疫力下降。此

10、外發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫顯著抑制了PtToll4、PtToll5基因在三疣梭子蟹血細(xì)胞中的表達(dá)，這可能是導(dǎo)致低鹽環(huán)境下三疣梭子蟹等甲殼類動(dòng)物免疫能力下降的原因之一。對(duì)PtToll5中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行抗病能力關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明未能有效關(guān)聯(lián)。綜上分析，PtToll4、PtToll5基因在三疣梭子蟹先天免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要功能，并為深入開展三疣梭子蟹和其他甲殼動(dòng)物的免疫調(diào)控機(jī)理研究提供了數(shù)據(jù)支持。
　　3.三疣梭子蟹HMGB家族基因的克隆與表

11、達(dá)分析
　　高遷移率族蛋白B(high-mobility groupboxprotein,HMGB)是一種典型的HMG家族蛋白，在調(diào)節(jié)DNA重組、修復(fù)、復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄方面均起著重要作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物中的HMGB1可由凋亡細(xì)胞或經(jīng)IL-1β等炎癥因子激活的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外并與先天免疫信號(hào)通路TLR家族中的TLR2、TLR4、TLR9等受體結(jié)合，調(diào)節(jié)多種免疫炎癥反應(yīng)。為研究三疣梭子HMGB家族基因在先天免疫中發(fā)揮的功能，本實(shí)

12、驗(yàn)利用RACE技術(shù)首次克隆得到了2個(gè)三疣梭子蟹HMGB基因，分別命名為PtHMGBa、PtHMGBb。其中，PtHMGBa基因cDNA序列全長(zhǎng)1030bp，開放閱讀框(ORF)為681bp，編碼了一個(gè)含有227個(gè)氨基酸，分子量25.82 kD，理論等電點(diǎn)為5.94的蛋白質(zhì)。PtHMGBb基因 cDNA序列全長(zhǎng)981bp，開放閱讀框(ORF)為618 bp，編碼了一個(gè)含有206個(gè)氨基酸，分子量24.07 kD，理論等電點(diǎn)為6.28的蛋白質(zhì)

13、。PtHMGBa和PtHMGBb蛋白均包含兩個(gè)HMG盒結(jié)構(gòu)域和一個(gè)酸性尾部結(jié)構(gòu)域，符合HMGB家族蛋白的典型特征。同源分析分析表明，PtHMGBa和PtHMGBb氨基酸序列分別與凡納濱對(duì)蝦LvHMGBa和LvHMGBb相似度最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，PtHMGBa、PtHMGBb基因均在血細(xì)胞的表達(dá)量最高。利用副溶血弧菌和WSSV對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行注射感染，結(jié)果表明，PtHMGBa基因經(jīng)副溶血弧菌感染6 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)且出現(xiàn)表達(dá)

14、量的峰值，為對(duì)照組的3.5倍(P＜0.05)，經(jīng)WSSV后，PtHMGBa于12 h出現(xiàn)顯著上調(diào)且達(dá)到對(duì)照組的2.3倍(P＜0.05)；經(jīng)副溶血弧菌感染后，PtHMGBb基因在三疣梭子蟹血細(xì)胞中，于24 h達(dá)到表達(dá)量的峰值，為對(duì)照組的2.5倍(P＜0.05)，經(jīng)WSSV感染后，PtHMGBb在12 h達(dá)到峰值，表達(dá)量達(dá)到了對(duì)照組的5.2倍(P＜0.05)。由此可知 PtHMGBa、PtHMGBb在不同病原入侵后都會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。而經(jīng)低鹽脅