1、咔唑是典型的含氮雜環(huán)芳烴污染物，具有致毒、致癌和致突變的“三致”作用，會(huì)給環(huán)境和人類帶來(lái)巨大的危害。微生物在環(huán)境治理方面具有高效、專一、經(jīng)濟(jì)和節(jié)能等諸多優(yōu)點(diǎn)，所以本實(shí)驗(yàn)利用微生物作為實(shí)驗(yàn)材料研究了咔唑降解的機(jī)制。本研究選擇了從咔唑污染土樣中分離得到的一株能夠降解咔唑的革蘭氏陰性菌鞘氨醇單胞菌JS061作材料來(lái)研究咔唑降解過(guò)程中各基因的特點(diǎn)及其編碼的酶蛋白的性質(zhì)。 從鞘氨醇單胞菌JS061菌株的基因組DNA中分離得到降解咔唑的上

2、游基因的基因簇，利用軟件和BLAST分析之后，證實(shí)我們獲得了完整的降解咔唑的上游基因。將該序列提交GenBank，獲得了該基因的序列號(hào)為EU854302。從BLAST比對(duì)結(jié)果和結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該基因簇是由基因carAaBCAc構(gòu)成，并且明確了該菌株中這幾個(gè)基因的排列順序?yàn)閏arAa→carB→carC→carAc。通過(guò)Southern雜交驗(yàn)證了該基因簇是來(lái)自于鞘氨醇單胞菌JS061基因組，并且以單拷貝的形式存在。 利用pET28a(

3、+)質(zhì)粒分別構(gòu)建了carAa，carAc，carB和carC基因的原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了這四種蛋白在BL21(DE3.0)中的表達(dá)。確定了這四種蛋白的分子量分別為43kDa，15kDa，29kDa(CarBa)/10kDa(CarBb)和31kDa。但構(gòu)成carB的兩個(gè)組分CarBa和CarBb的表達(dá)比例上與其他菌種表達(dá)的CarB蛋白有很大差別。同時(shí)本研究利用底物顯色反應(yīng)驗(yàn)證了pETWB重組質(zhì)粒中表達(dá)的CarB蛋白具有裂解2，3-二羥基聯(lián)

4、苯的生物學(xué)活性。 本實(shí)驗(yàn)利用Ni-NTAagarose成功的純化了含有六個(gè)組氨酸的CarB和CarC融合蛋白，并利用BALB/c雌性小鼠制備了CarC蛋白的多克隆抗體。利用該抗體在蛋白水平檢測(cè)了Sphingomonassp.JS061中carC蛋白在不同底物濃度時(shí)的表達(dá)情況以及在相同濃度下不同誘導(dǎo)時(shí)間的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)了該蛋白只有在有底物存在時(shí)才表達(dá)，而且在誘導(dǎo)時(shí)間相同、底物濃度不同時(shí)蛋白表達(dá)有明顯的差別，證明了降解咔唑