1、井岡霉素是我國自主研發(fā)并實現大規(guī)模產業(yè)化生產的第一個農用抗生素，主要由吸水鏈霉菌井岡變種（Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis）產生。它對防治水稻紋枯病具有特效，在亞洲的水稻產區(qū)需求量巨大。同時，井岡霉素及其衍生物可作為治療II型糖尿病的藥物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前體，具有很高的經濟附加值。鑒于其市場需求的不斷攀升，利用代謝調控和基因工程手段來優(yōu)化井岡霉素高產菌株的發(fā)酵性能，獲得產量

2、進一步提高的菌株，是本論文的研究重點。
　　前期研究發(fā)現井岡霉素野生型菌株5008中存在三套同源的afsA-arpA代謝調控基因，組合缺失A因子受體基因shbR1和shbR3能明顯上調valABC的轉錄水平，井岡霉素的終產量提高約40％。因此，我們首先通過缺失高產菌株TL01中shbR1和shbR3基因，促使井岡霉素的發(fā)酵產量分別提升14%和11%，在組合缺失菌株中井岡霉素的終產量由22.5g/L提高到28g/L。
　　商品

3、化的井岡霉素粗品通常包含約70%的A組分，15%的B組分，以及其他類似物。與有效成分A組分相比，B組分具有明顯低效的抗病原真菌活性。前期研究推測ValE與ValJ蛋白可能催化A組分轉化成B組分。在缺失valE基因后，突變株只產生少量的B組分；在缺失valJ基因后，突變株中B組分的含量與出發(fā)菌株相比減少了35%。并且不論是缺失valE基因，還是缺失valJ基因，對井岡霉素A的產量沒有影響。由此，通過基因工程改造，我們成功實現了井岡霉素A組

4、分的特異性積累。
　　井岡霉素工業(yè)發(fā)酵中會產生大量的色素，48小時發(fā)酵液呈現深褐色，加大了下游分離純化的難度，并影響了產品的色澤、產率和質量。為了消除發(fā)酵液中的色素，我們通過全基因組分析，在基因組中尋找到了四組可能參與色素合成的基因，分別參與以酪氨酸為前體的黑色素、III型聚酮合酶（以下簡稱為PKS）編碼的黑色素、II型PKS編碼的孢子色素、來源于尿黑酸的褐黃素的合成。通過對上述基因簇進行逐一中斷，和出發(fā)菌株TL01相比，多巴類黑

5、色素基因突變株PY06中井岡霉素的發(fā)酵產量提高了12%；III型PKS編碼的黑色素基因簇突變株PY07產量無明顯變化；II型PKS編碼的孢子色素基因簇缺失和褐黃素基因缺失，分別導致井岡霉素產量下降11.7%和17.2%。所有突變株中井岡霉素基因簇轉錄水平和發(fā)酵液顏色均沒有明顯變化。
　　基于上述改造過的高產菌株，我們進一步中斷井岡霉素生物合成基因簇，成功構建了用于高效表達氨基環(huán)醇類化合物的異源宿主。一方面，我們將包含阿卡波糖天然合

6、成基因簇的整合型質粒引入到阿卡波糖基因簇被中斷的原始菌株Actinoplanessp. SE50/110（acb）中，可以檢測到阿卡波糖合成能力的恢復。但該基因簇在Streptomyces coelicolorM145和Streptomyceslividans1326中的轉錄量極低，檢測不到阿卡波糖的產生。這暗示可能存在未知的副調控基因抑制阿卡波糖天然合成基因簇的轉錄，或者缺乏激活該基因簇表達的正調控基因。另一方面，我們選用井岡霉素基因