1、牛乳中蛋白質含量豐富，其中酪蛋白經(jīng)體外酶解可產(chǎn)生不同功能的活性肽，已有動物體內實驗證實這些肽類具有生理作用。這些活性肽多由3個以上氨基酸殘基組成，但對大于3個氨基酸殘基的多肽腸道吸收形式和吸收機制研究較少，闡明多肽的腸道吸收機制對活性肽的作用機理及功能評價顯得尤為重要。
　　本課題以牛乳酪蛋白為原料，對其進行體外模擬消化，探討胃腸消化條件下的ACE（血管緊張素轉化酶）抑制肽及抗氧化肽活性，RP-HPLC分析水解液組成變化，LC-M

2、S/MS鑒定肽段序列；再通過體內消化熒光標記的牛乳酪蛋白，利用激光共聚焦顯微鏡、RP-HPLC及全波長功能讀數(shù)儀檢測FITC-酪蛋白水解物在大鼠腸道粘膜上的吸收情況；最后，建立Caco-2單層細胞模型，通過添加不同抑制劑研究6種ACE抑制肽在細胞水平的吸收形式及吸收機制。主要研究結果如下：
　　1．體外模擬消化牛乳酪蛋白水解物的生物活性研究。模擬胃、腸及胃腸聯(lián)合水解三種消化方式中，胃腸模擬消化的水解度最大，為25.51±0.41％

3、；通過ACE法及DPPH自由基法分別對水解液中ACE抑制活性及抗氧化活性進行檢測，在消化1h內，三種消化方式的DPPH自由基清除率都增加較快，分別增加了18.25±0.72%、25.82±1.15%和41.78±0.71%，在2h時胃腸聯(lián)合消化的DPPH自由基清除率達到最大為44.27±0.93%；胃腸聯(lián)合水解液的ACE抑制率顯著高于兩種單獨消化方式，并在消化2h時ACE抑制活性達到最高值68.03±1.14%。分析LC-MS/MS二級

4、質譜鑒定結果，發(fā)現(xiàn)可能具有ACE活性的肽段有21種，活性還需進一步驗證。
　　2．FITC-牛乳酪蛋白大鼠體內吸收研究。采用FITC（異硫酸熒光素）標記酪蛋白，對標記率為13.91%的樣品使用SDS-PAGE電泳評價FITC-酪蛋白在胃腸消化液中的穩(wěn)定性。結果表明人工胃液和腸液消化5h，消化液的分子量為11kDa左右，且熒光條帶清晰；Tricine-SDS-PAGE電泳檢測胃腸消化液，2h蛋白條帶主要集中在5kDa以下，熒光條帶清

5、晰，可用于跟蹤胃腸吸收情況。FITC-酪蛋白大鼠灌胃實驗得出，在灌胃1h后十二指腸粘膜下層的熒光強度為1047.12±157.82RFU，占總熒光強度的3.3%，灌胃3h熒光顯著增強達到2073.44±119.31RFU，占總熒光強度的6.5%，激光共聚焦顯微鏡觀察可知酪蛋白水解物在大鼠體內可被很快吸收。建立大鼠腸非翻轉模型，驗證5kDa以下的FITC-酪蛋白水解液被小腸不同腸段的吸收率大小依次為：十二指腸吸收＞空腸吸收＞回腸吸收＞結腸

6、吸收，且主要被十二指腸吸收。
　　3．基于Caco-2細胞模型的ACE抑制肽吸收機制研究。Caco-2單層細胞膜模型指標評價結果為：培養(yǎng)16天時細胞形態(tài)良好，生長均勻，單層膜基本成型；熒光黃的Papp為6.06×10-7；15天時AP/BL側酶活比為7.60，說明堿性磷酸酶已經(jīng)主要分布于AP側，極化現(xiàn)象已經(jīng)很明顯；單層膜的電阻為417Ω·cm2，以上各條件均已符合Caco-2單層膜的要求，說明Caco-2單層細胞模型建立成功。選擇

7、胃腸消化條件下產(chǎn)生的6種ACE抑制肽：IPP、RYLGY、LHLPLP、AYFYPEL、RPKHPIKHQ及WQVLPNAVPAK。合成6種ACE抑制肽探討其轉運機制。以RYLGY為模型，對影響ACE抑制肽的跨膜轉運量的主要因素進行優(yōu)化，確定最佳轉膜條件為多肽濃度5mmol/L、轉運時間90min、pH7.4及轉運方向由AP-BL。采用跨膜轉運抑制劑氧化苯胂、去氧膽酸鈉、Gly-pro、維拉帕米、疊氮化鈉及MK-571鈉鹽研究6種ACE

8、抑制肽吸收機制。6種ACE抑制肽的吸收和外排機制如下：6種ACE抑制肽均是以旁路轉運的方式通過小腸上皮細胞；IPP可能存在能量依賴性的外排作用；RYLGY、LHLPLP和RPKHPIKHQ均是以P糖蛋白進行外排轉運并且需要ATP提供能量；AYFYPEL是以P糖蛋白的方式進行外排轉運；WQVLPNAVPAK則是以 MRP2進行外排轉運且需要ATP提供能力。RP-HPLC表明6種肽均能完整通過Caco-2單層細胞膜，最后通過LC-MS/MS