1、背景：心血管疾病是全球范圍導致人類死亡的首要病因，近些年來每年全球范圍內(nèi)因心血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的比例均超過30％，已經(jīng)造成了沉重的社會經(jīng)濟負擔。心肌梗死是最常見的心血管疾病類型，在人群中具有很高的發(fā)病率和死亡率。心肌梗死導致心臟永久性損失數(shù)以億計的功能心肌細胞，這些壞死損失的心肌細胞逐漸被成纖維細胞所形成的瘢痕組織替代，心臟隨之發(fā)生重構(gòu)，存活的患者最終將發(fā)展為心力衰竭直至死亡。
　　人類心臟再生能力極為有限，一旦發(fā)生心

2、肌梗死，功能心肌細胞的損失將無法得到彌補。當前所有的治療方法和策略均只為補救性措施，比如藥物治療、冠脈介入手術(shù)治療、以及外科搭橋手術(shù)治療，雖然可以有效延緩疾病的發(fā)展，但它們均無法完全恢復心臟的功能或是逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)。全心移植是重癥心肌梗死患者目前唯一最有效的根治性治療選擇。在過去的十多年中，干細胞生物學方面的重大突破使得我們已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)心肌細胞的再生，使得為這類疾病患者提供再生心臟的美好愿望成為可能。然而，當前基于干細胞的移植再生療法仍然

3、存在諸如細胞存活差、細胞滯留低、無法形成功能性心肌組織等難題，尚難以取得滿意療效。因此體外構(gòu)建出可供移植的組織工程心肌移植體就成為了當前新的選擇。
　　目的：利用誘導多能干細胞與納米纖維支架構(gòu)建較為成熟、具有機械/電偶聯(lián)的一體化組織工程心肌移植物。
　　方法：
　　1)分別采用擬胚體法和單層貼壁培養(yǎng)法進行鼠源Oct4-GFP+ iPSC（induced pluripotent stem cell）培養(yǎng)分化，并進行心肌細

4、胞標志物免疫染色，明確該iPSC細胞系向心肌細胞分化的可行性。
　　2)添加抗壞血酸素（Ascorbic acid,AA）作為心肌分化誘導劑，觀察、計數(shù)跳動EB的數(shù)量，借以評估抗壞血酸素的心肌分化誘導作用。
　　3)采用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)聚己內(nèi)酯（Poly-(ε-caprolactone), PCL）和聚己內(nèi)酯/明膠（PCL/Gelatin）復合納米纖維支架，用于iPSC的心肌分化誘導培養(yǎng)，明確支架平臺可否適用于組織工程心肌構(gòu)

5、建。
　　4)觀察支架對iPSC心肌方向分化的作用，并探討支架微觀形貌對于心肌分化的影響及可能的信號機制。
　　5)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導劑進一步提高心肌分化效率，獲取大批量高純度心肌細胞。
　　6)利用納米纖維支架進行iPSC源心肌細胞的成熟化培養(yǎng)，并進行成熟化指標評價。
　　7)采用單層法聯(lián)合多種分化誘導劑在納米纖維支架上培養(yǎng)構(gòu)建具有自主節(jié)律、能夠同步收縮/舒張活動的組織工程心肌。
　　結(jié)果：

6、>　　1)采用懸滴法制得大小均一的擬胚體細胞團，能夠自發(fā)分化出少量跳動的擬胚體；添加抗壞血酸素能夠顯著升高跳動擬胚體的比例，有效促進心肌分化；單層貼壁法同樣也可以誘導我們的iPSC細胞系分化出心肌細胞，免疫染色結(jié)果證實cTnI陽性細胞存在。證明該iPSC細胞具備心肌分化能力，可用于后續(xù)心肌組織構(gòu)建。
　　2)靜電紡絲技術(shù)成功制得纖維直徑為納米級別的PCL和PCL/Gelatin復合支架，具備與細胞外基質(zhì)類似的多孔隙三維立體結(jié)構(gòu)；支

7、架用于iPSC的培養(yǎng)分化能夠獲得cTnT陽性、MLC2a陽性的心肌細胞，而且動態(tài)基因表達譜及心肌特異性蛋白質(zhì)表達譜，均證實心肌細胞存在。證實這種納米纖維支架平臺適用于iPSC的心肌分化培養(yǎng)。
　　3)同等分化條件下采用納米纖維支架具有比培養(yǎng)皿更強的促iPSC心肌細胞分化作用，我們認為這一作用與納米纖維支架的微觀形貌有關(guān)。進一步調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路，證實其參與了這一促分化作用。
　　4)三維納米纖維支架聯(lián)合多種促心肌細胞分化

8、因子，能夠促進iPSC在支架上高效向心肌細胞分化。
　　5)支架上分化獲得的心肌細胞在肌節(jié)結(jié)構(gòu)、心肌特異性蛋白MLC2v的表達方面顯著強于培養(yǎng)皿對照，提示納米纖維支架能夠有效促進分化心肌細胞的成熟。
　　6)通過綜合運用分化誘導因子、納米纖維支架和延長培養(yǎng)時間等措施，成功促使心肌細胞肌節(jié)發(fā)育更為完善、電鏡下結(jié)構(gòu)更為清晰、蛋白表達譜也更為成熟。
　　7)利用支架作為培養(yǎng)載體，成功培養(yǎng)出具有自主節(jié)律、同步收縮/舒張的成熟心