1、可逆的磷酸化過程在細(xì)胞增殖、分化、代謝、細(xì)胞間通訊以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，真核細(xì)胞中，有近25-30％的蛋白在其生活史中會經(jīng)歷磷酸化過程。因此，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是翻譯后修飾蛋白質(zhì)組研究中的熱點之一。目前，包括MALDI源和ESI源在內(nèi)的質(zhì)譜儀以其高靈敏度、準(zhǔn)確度和分辨率而被廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。由于磷酸化蛋白在生物體內(nèi)含量很低，且在質(zhì)譜分析時易受到非磷酸肽的干擾，因而磷酸肽和磷酸化蛋白質(zhì)的富集成為

2、磷酸化肽段和磷酸化蛋白質(zhì)分析的一個關(guān)鍵步驟。目前已經(jīng)有很多富集磷酸肽的方法和技術(shù)，但這些方法在應(yīng)用時仍然存在不少問題，因而需要發(fā)展新的富集方法，以滿足大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組分析的需要?；诖?，本文開展了一種磷酸肽富集的新方法研究，并將其應(yīng)用于復(fù)雜樣品的分析。
　　 本課題發(fā)展的方法為一種利用鍵合磷酸鋯開管毛細(xì)管柱的制備及用于快速富集磷酸肽的新方法。其過程是通過酸堿活化熔融石英毛細(xì)管內(nèi)表面，使其帶有自由的硅羥基，在硅羥基表面引入3-

3、氨丙基三乙氧基硅烷，之后再分別引入甲基丙烯酸甲酯和乙二胺，如此進行三輪反應(yīng)后，在形成的樹枝狀大分子表面進行磷酸基團修飾并與鋯離子生成磷酸鹽，最終合成具有特異性吸附磷酸肽分子的多層開管毛細(xì)管柱。
　　 進一步對該多層開管毛細(xì)管柱的富集條件進行了優(yōu)化，確定出當(dāng)開管毛細(xì)管柱長度為50 cm時，標(biāo)準(zhǔn)磷酸肽的進樣流速在0.3 μL/min-0.5μL/min時，均有很好的富集效果。并且在同樣的流速條件下，使用不同內(nèi)徑的多層開管柱進行富集時

4、，富集效果沒有顯著性差異。同時還考察了強陽離子交換色譜分離中分離效果較好的鹽，如氯化銨對富集效果的影響，以便該方法與復(fù)雜樣本的預(yù)分離過程相兼容。之后，還用合成的磷酸肽段(FLpTEYVATR)與外標(biāo)法相結(jié)合，對開管毛細(xì)管柱的負(fù)載量和回收率等進行考察，確定出負(fù)載量為48 pmol，回收率為94.1％（50 cm×50 μm）。利用α酪蛋白與BSA混合酶切溶液，考察了毛細(xì)管開管柱的選擇性和檢測靈敏度，結(jié)果表明此方法對磷酸肽有較高的選擇性，且