1、雙水相分配技術(shù)的研究近來(lái)出現(xiàn)了新的動(dòng)態(tài)，其中以聚皂構(gòu)成的雙水相膠束系統(tǒng)比較突出，其分配推動(dòng)力主要來(lái)自于靜電相互作用。本文針對(duì)雙水相膠束系統(tǒng)的特點(diǎn)及應(yīng)用前景作了較為全面的分析，論文對(duì)下列三方面內(nèi)容展開(kāi)研究：疏水季銨化改性聚氧乙烯(HyaminemodifiedHM-EO)的制備及測(cè)定方法、HM-EO及其季銨化改性聚合物的膠束性質(zhì)及液液平衡性質(zhì)和利用這類聚合物構(gòu)成的雙水相膠束系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究。 采用HM-EO的丙酮-水

2、溶液與過(guò)量的鹵烷(CH3Br、CH3CH2Br和n-CH3(CH2)3Br)在低溫?cái)嚢琛⒊暡l件下進(jìn)行親核取代反應(yīng)，制備得到季銨型疏水改性聚氧乙烯N-R-HM-EO[R=CH3(Me)，CH3CH2(Et)，n-CH3(CH2)3(n-Bu)]。建立了以丙酮為助溶劑，以考馬斯亮藍(lán)G250為顯色劑的分光光度法，快速準(zhǔn)確地測(cè)定了HM-EO及其季銨化改性聚合物的濃度，確定了分光光度法的顯色劑用量及顯色反應(yīng)時(shí)間。研究表明，常見(jiàn)無(wú)機(jī)鹽如NaCl

3、，KBr和Na2SO4及待測(cè)液的pH值對(duì)該方法無(wú)干擾，而小分子表面活性劑如SDS的加入對(duì)該方法有較大的干擾，該方法準(zhǔn)確度與精密度均高于重量法。 為了更好地了解聚皂類雙水相膠束系統(tǒng)的相行為和電化學(xué)分配的影響因素，本文采用熒光探針?lè)▽?duì)HM-EO及其季銨化改性聚合物的膠束性質(zhì)進(jìn)行了研究。季銨型HM-EO由于其離子頭基比叔胺型HM-EO更易電離，帶電性增強(qiáng)，其臨界膠束濃度(CMC)高于叔胺型HM-EO，膠束聚集數(shù)則少于叔胺型HM-EO。

4、考察了鹽效應(yīng)、溶液pH值和溫度對(duì)四種聚皂形成膠束性質(zhì)的影響，結(jié)果表明鹽濃度增加，膠束的雙電層壓縮，使膠束離子頭基之間靜電斥力作用減弱，膠束中疏水基團(tuán)排列更為緊密，膠束的聚集數(shù)增加，聚皂的CMC下降；溶液pH值對(duì)叔胺型HM-EO形成的膠束影響顯著，而對(duì)季銨型HM-EO形成的膠束性質(zhì)影響不大；隨著溫度的增加，四種聚皂的CMC下降，聚皂的膠束聚集數(shù)也略有增加?？疾炝薍M-EO與SDS混合物在純水溶液中的膠束性質(zhì)，SDS的離子頭基與HM-EO中

5、表面活性結(jié)構(gòu)單元可形成混合膠束，混合膠束的性質(zhì)取決于膠束中SDS分子與HM-EO表面活性結(jié)構(gòu)單元結(jié)構(gòu)的比例以及膠束的聚集數(shù)。 研究了HM-EO及其季銨化改性聚皂形成的雙水相膠束系統(tǒng)的液液相平衡性質(zhì)，隨著pH值的增加，HM-EO-緩沖液系統(tǒng)的兩相區(qū)域逐漸變大，而HM-EO季銨化改性聚合物形成的雙水相系統(tǒng)兩相區(qū)域變化程度很小。溶液中鹽濃度的增加有利于雙水相系統(tǒng)的形成，與叔胺型聚合物相比較，鹽離子對(duì)季銨型聚皂膠束之間的靜電作用的影響更

6、強(qiáng)，對(duì)其相圖的影響也更為顯著?？疾炝瞬煌庪x子和陽(yáng)離子在相同濃度下對(duì)系統(tǒng)相圖的影響。陰離子對(duì)增大HM-EO-H2O雙水相兩相區(qū)域的作用次序?yàn)椋篠O42-＞F-＞Cl-＞Br-＞I-；陽(yáng)離子的作用次序?yàn)椋篕+＞Na+?？疾炝薍M-EO與SDS形成的混合雙水相膠束系統(tǒng)的相行為，隨著SDS加入量的增加，SDS和HM-EO在上下兩相中的濃度差均逐漸減小，直至空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的解體及雙水相系統(tǒng)的消失。 分別考察了兩種模型蛋白BSA和溶菌酶在等

7、電點(diǎn)和pH7.0時(shí)雙水相膠束系統(tǒng)中的分配情況，結(jié)果表明等電點(diǎn)時(shí)模型蛋白主要受疏水相互作用及體積排阻作用等因素而主要分配于上相；在pH均為7.0的系統(tǒng)中，靜電相互作用較大的系統(tǒng)是HM-EO/SDS和N-Me-HM-EO-緩沖液系統(tǒng)，相對(duì)而言，N-Me-HM-EO-緩沖液體系是一種較理想的靜電作用力主導(dǎo)的雙水相系統(tǒng)?？疾炝讼到y(tǒng)pH、電導(dǎo)率及溫度對(duì)模型蛋白在HM-EO-緩沖液、HM-EO/SDS和N-Me-HM-EO-緩沖液系統(tǒng)中分配的影響，

8、結(jié)果表明pH決定了模型蛋白的電性及帶電量，因而對(duì)分配的影響顯著；系統(tǒng)的電導(dǎo)率在一定條件下與系統(tǒng)中的離子強(qiáng)度呈正相關(guān)，較低的離子強(qiáng)度對(duì)保持較強(qiáng)雙水相膠束系統(tǒng)中的靜電相互作用有利，實(shí)驗(yàn)選用系統(tǒng)的電導(dǎo)率為2.0mS/cm左右；較高的分配溫度有利于系統(tǒng)中聚皂膠束的形成，從而加強(qiáng)聚皂膠束與蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，但會(huì)造成一定的酶活損失，為了獲得較高的酶活回收率，分配實(shí)驗(yàn)所選用的分配溫度為10～25℃?？疾炝薙DS加入量對(duì)模型蛋白在HM-EO/S

9、DS系統(tǒng)中分配行為的影響，結(jié)果表明，當(dāng)系統(tǒng)中SDS的濃度為0.1％(w/w)時(shí)，兩種模型蛋白均達(dá)到了最佳的分配效果。采用Kamei等的分配模型描述了N-Me-HM-EO-水系統(tǒng)中的靜電相互作用，驗(yàn)證了兩種模型蛋白的電化學(xué)分配系數(shù)，并與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行了比較，結(jié)果表明模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值符合較好。 研究了P450BM-3在N-Me-HM-EO-緩沖液體系統(tǒng)中的分配行為，優(yōu)化了雙水相分配的條件，通過(guò)不同pH時(shí)破胞液中P450BM-3及雜蛋白

10、的分配情況，確定了兩步雙水相萃取法分離P450BM-3的工藝。結(jié)果顯示，經(jīng)第一步分配(pH8.0系統(tǒng))后，P450BM-3的酶活回收率為86.3％，但純化倍數(shù)僅為1.22，僅除去少量雜蛋白，而經(jīng)透析及第二步分配后，純化倍數(shù)提高到2.54，酶活回收率下降到73.3％。進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大分配實(shí)驗(yàn)，采用pH6.0系統(tǒng)一步分配，系統(tǒng)放大倍數(shù)為10倍，P450BM-3的分配系數(shù)(Ke)為11.62，酶活回收率為75.8％，純化倍數(shù)為1.92。