蛋白質的磁性微球快速酶解與高效富集新方法研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本論文針對蛋白質組學研究中面臨的快速酶解以及磷酸化蛋白高效選擇性富集方面的熱點難點問題,將功能化磁性微球與蛋白質分析結合起來,開展了一系列研究工作,發(fā)展了相關的新技術新方法并進行了實際的應用研究,取得了一些創(chuàng)新性研究結果。主要研究內容和取得的主要研究成果摘要如下:
   第一章概述了蛋白質組學研究的現(xiàn)狀,基于生物質譜的蛋白質組學研究技術以及新興的翻譯后修飾蛋白組學的重要意義;就目前固定化酶反應器及其在蛋白質組學研究中的應用,以及

2、磷酸化蛋白質組學研究中的富集技術研究進展進行了綜述;概述了功能化磁性微球及其在生物分析中的應用;最后提出了本論文選題的目的和意義。
   第二章分別運用金屬離子螯合和共價鍵合兩條技術路線,合成了表面固定酶的磁性硅球材料并將其應用于毛細管/微流控芯片酶解反應器。首先,采用水熱法制備了具有超順磁性的四氧化三鐵磁性微球;然后采用溶膠-凝膠法在其表面包覆二氧化硅層,合成了具有核殼結構的Fe3O4@SiO2磁性硅球。在此基礎上,發(fā)展了兩條

3、不同的固定酶的方法,即金屬離子螯合法和共價鍵合法,將胰蛋白酶固定在磁性硅球表面。
   利用外加磁場的作用,在不需要制作塞子的情況下,將用兩種不同方法合成的固定酶的磁性硅球分別填充到毛細管或者微流控芯片通道內部。蛋白質溶液在泵的推動下,流過毛細管或者微流控芯片通道,從而得到快速的酶解。使用MALDI質譜對收集到的酶解產物進行分析鑒定。結果表明,用兩種不同的固定酶方法制得的毛細管/微流控芯片酶反應器均能在5分鐘的酶解時間內達到與1

4、2小時傳統(tǒng)溶液酶解相同或更好的酶解效果。該方法易于操作、成本低;由于材料的磁性,毛細管/芯片通道內的磁性微球還可以進行方便快速地替換,很好地解決了以前文獻報道中毛細管/芯片酶反應器只能一次性使用的缺點。對用金屬離子螯合方法固定酶的磁性微球而言,還可以用EDTA將磁性微球表面的銅離子除去,再重新引入新的銅離子和蛋白酶,從而實現(xiàn)毛細管/微流控芯片酶反應器的再生。
   第三章發(fā)展了更為簡便的方法,運用一步水熱法合成了氨基四氧化三鐵磁

5、性微球,從而將固定酶的磁性微球的合成步驟由第二章中的6步簡化到3步,大大縮短了合成的時間。
   在上述工作的基礎上,將固定酶的磁性微球進一步應用于蛋白質的靶上酶解。將磁性微球分散液滴加到已經預先滴加好蛋白溶液的靶板上,酶解一段時間后,用磁化的鋼針把固定酶的磁性微球從靶板上分離出來,從而終止酶解過程。這樣,我們既利用了固定化酶技術提高了酶解效率,又避免了對質譜離子源光柵的污染。最后,為了證實本方法在復雜生物樣品檢測中的實際應用性

6、,我們對大鼠肝臟提取蛋白的液相色譜流分就行了酶解鑒定。
   第四章針對翻譯后修飾蛋白質組研究中亟待解決的磷酸化蛋白及肽段的分離富集問題,用固定金屬親和色譜(IMAC)原理,在Fe3O4@SiO2磁性硅球表面鍵合上可以螯合金屬離子的官能基團,再將對磷酸化蛋白/肽段有特異性吸附作用的鈰離子固定在磁球表面。由于材料的磁性,當磷酸化肽段富集到磁性微球上以后,只需將磁鐵放置在盛放溶液的離心管外壁,就可以輕松實現(xiàn)富集了磷酸化肽段的磁性微球

7、與非磷酸化肽段溶液的分離。文獻調研顯示,F(xiàn)e3+和Ga3+是IMAC富集中最常使用的金屬離子,而目前尚未有將Ce4+成功地應用于磷酸化肽富集的文獻見諸報道。因此,在本論文中,我們還進一步比較了螯合Ce4+的磁性微球與螯合Fe3+的磁性微球對磷酸化肽段的富集效率。結果表明,螯合Ce4+的磁性微球對復雜混合物中磷酸化肽段的選擇性富集效果優(yōu)于螯合Fe3+的磁性微球。即使在酶解肽段溶液中BSA的量是β-casein的量的50倍的情況下,螯合Ce

8、4+的磁性微球仍可在30 s內將β-casein中的痕量磷酸化肽段有效地富集出來。在此基礎上,我們還首次成功地將螯合Ce4+的磁性微球用于選擇性富集人血清中(不需要其它的預處理步驟)的磷酸化肽段,為磷酸化蛋白質組學的研究開辟了新的道路。
   第五章創(chuàng)新性地探索了在四氧化三鐵磁性微球表面均勻包覆過渡金屬氧化物的新方法。采用磁球外部包覆碳層為模板包覆過渡金屬氧化物、隨后灼燒去除碳層的方法,制備了結構緊密的具有核殼結構的Fe3O4@

9、MxOy超順磁性微球。該磁性微球具有與IMAC材料不同的富集機理,具有更高的化學惰性和穩(wěn)定性。利用該方法將不同的過渡金屬氧化物,如Al2O3,ZrO2,Ga2O3等分別包覆到四氧化三鐵磁性微球表面。采用振動樣品磁場計、傅立葉變換紅外光譜儀、透射及掃描電子顯微鏡等對產物進行了表征與確認。我們進而優(yōu)化了這些材料富集磷酸化肽段的實驗條件,包括富集體系、富集時間、樣品洗脫時間等,驗證了表面包覆不同金屬氧化物的Fe3O4@MxOy磁性微球對于復雜

10、體系中的磷酸化肽段均有很好的選擇性富集效果,并進一步將其應用于人血清及脫脂牛奶、鼠肝蛋白酶解產物中磷酸化肽的富集鑒定。
   總之,本論文針對蛋白質組學研究中面臨的快速酶解與高效富集方面的熱點難點問題,以功能化磁性微球為基礎,以發(fā)展相關的蛋白質組學研究新技術新方法并進行實際的應用研究為目標,合成了多種表面帶有不同功能基團的磁性微球并建立了相應的分析方法,為解決蛋白質快速酶解、磷酸化肽段高效分離富集及鑒定等問題提供了新穎有效的研究

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