1、ABCG(ATP-binding cassette transporter G)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)子的一個(gè)成員，是一類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過水解ATP的能量對(duì)胞質(zhì)中的外源化合物、代謝產(chǎn)物、離子、糖、氨基酸、脂類等物質(zhì)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。本文以我國(guó)漁用抗生素的使用情況為依據(jù)，以甲殼類重要養(yǎng)殖品種三疣梭子蟹為研究對(duì)象，以養(yǎng)殖過程中常用抗生素——氟苯尼考(FLR)為代表，采用ABCG蛋白特異性抑制劑——煙曲霉毒素C(FTC)對(duì)比研究了氟苯尼考在三

2、疣梭子蟹重要組織中的分布及消除情況；首次克隆了三疣梭子蟹ABCG蛋白基因，并測(cè)定了氟苯尼考的解毒代謝相關(guān)酶及相關(guān)基因的表達(dá)，并且初步研究了FLR對(duì)三疣梭子蟹免疫和抗氧化系統(tǒng)的影響。得到如下結(jié)果：
　　1.ABCG蛋白對(duì)氟苯尼考轉(zhuǎn)運(yùn)活力的測(cè)定
　　為檢測(cè)三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)氟苯尼考轉(zhuǎn)運(yùn)活力的大小，本實(shí)驗(yàn)通過注射ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性抑制劑——FTC，比較有無抑制劑對(duì)三疣梭子蟹組織中氟苯尼考累積及消除的變化。結(jié)果表明，在

3、40mg/kg氟苯尼考劑量下，藥物在體內(nèi)的累積階段，注射抑制劑FTC組的氟苯尼考在肝胰腺、肌肉、鰓和血淋巴中的累積量均高于無抑制劑組，達(dá)峰時(shí)間晚。藥物消除階段，抑制劑組消除速度比無抑制劑組緩慢一些，在血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓中的藥物消除半衰期(t1/2)分別是0.85、1.25、1.91、1.35h，而無抑制劑組對(duì)應(yīng)的消除半衰期為0.80、1.00、1.72、1.73h，由此表明三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)了氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝。從各組

4、織ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活力來看，血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓組織分別在3、3、3、6h達(dá)到最大值，然后逐漸降低。轉(zhuǎn)運(yùn)活力的大小與各組織中氟苯尼考的累積量相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步證明了三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。
　　2.氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹不同組織中ptABCG基因表達(dá)量的影響
　　為深入研究ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氟苯尼考代謝過程中的作用，采用RACE技術(shù)克隆獲得三疣梭子蟹ABCG的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為ptABCG(Ge

5、nBank登錄號(hào)：KY242401)。該基因全長(zhǎng)2473bp，包括1747bp的開放閱讀框(ORF)，25bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和701bp的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。結(jié)構(gòu)功能域分析顯示，該蛋白具有半轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征，含有1個(gè)疏水性的跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)和1個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)(nucleotide binding domain,NBD)；存在由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的2種跨膜螺

6、旋，因此可判斷獲得的cDNA序列是三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列。采用RT-PCR法，從mRNA水平分析氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鰓中ptABCG表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，40mg/kg劑量下，3h前FTC+FLR組各組織中ptABCG的相對(duì)表達(dá)水平受到抑制，顯著低于FLR組(P＜0.05)，隨著抑制劑作用的減弱表達(dá)水平迅速提高，肝胰腺、肌肉、鰓中的表達(dá)量分別于12、6、12h達(dá)到峰值，且高于FLR組，最終兩組的表達(dá)都趨于對(duì)照水

7、平。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果從基因水平表明了三疣梭子蟹ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氟苯尼考的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝中發(fā)揮著一定的作用。
　　3.氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹解毒代謝途徑的影響研究
　　為研究氟苯尼考在三疣梭子蟹體內(nèi)的解毒代謝途徑，測(cè)定了I相解毒代謝酶(APND)、II相解毒代謝酶(GST)的活性及對(duì)應(yīng)基因CYP2、GST和Ⅲ相代謝ABCG基因的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果表明，氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹各相酶活力及基因表達(dá)的影響顯著(P＜0.05)，且呈時(shí)間-劑量效應(yīng)，對(duì)照

8、組則無明顯變化。氟苯尼考對(duì)肝胰腺、血淋巴APND及CYP2 mRNA表達(dá)具有抑制作用，于6h達(dá)最低值，隨后逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平；對(duì)肝胰腺GST活性及GST mRNA表達(dá)呈誘導(dǎo)作用，且呈現(xiàn)高劑量組>中劑量組>低劑量組。對(duì)血細(xì)胞中GST mRNA表達(dá)的影響與藥物濃度有關(guān)，低、中劑量組誘導(dǎo)GST mRNA表達(dá)，而高劑量組的表達(dá)活受到抑制，于6h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。不同濃度氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺、鰓、肌肉ABCG mRNA的表

9、達(dá)均具有誘導(dǎo)作用，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并有一定的時(shí)間劑量效應(yīng)。由此推斷，ABCG蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)作用隨著藥物及代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的累積而增強(qiáng)，并且及時(shí)將其排出體外，以防對(duì)生物體造成損傷。
　　4.氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹生理健康指標(biāo)的影響
　　為研究氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹生理健康的影響，對(duì)免疫效應(yīng)和抗氧化防御兩個(gè)方面的主要指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹免疫系統(tǒng)中的抗菌和酚氧化酶活力具有顯著的抑制作用(P＜0.

10、05)，且各劑量組出現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量效應(yīng)；對(duì)溶菌活力的變化則無顯著影響(P＞0.05)。氟苯尼考對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺、血淋巴中的總抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力、GSH活性均產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05)，肝胰腺中T-AOC、SOD、GSH分別于6、6、12h達(dá)到最低值，血淋巴中于3、3、6h達(dá)到最低值，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，低(20mg/kg)、中(40mg/kg)劑量組各抗氧化指標(biāo)逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平，而高(80mg/kg)劑量組的活