1、本博士學位論文工作的主要集中于基于基質輔助激光解析飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)的新方法新技術新發(fā)展及其在在蛋白質組學領域中的應用研究。在痕量多肽富集除鹽的研究方面取得了創(chuàng)新性的進展,利用嵌段共聚物成功實現(xiàn)了樣品高效靶上原位除鹽與富集后直接用于MALDI-TOFMS分析,并成功應用到實際樣品小鼠肝臟的蛋白質組學研究中。在蛋白質直接靶上酶解技術方面,發(fā)展了以樹枝狀聚合物-碳納米管為基體,將胰蛋白酶固定在樹枝狀聚合物的表面得到可溶性

2、的固定化酶,成功實現(xiàn)了蛋白質在靶板上快速酶解后直接用于MALDI-TOFMS分析,特別適用于低豐度蛋白質的高效酶解和質譜鑒定。在基質方面開展了針對磷酸化多肽、寡聚糖和磷脂離子化效率低等問題的研究工作,對基質體系進行研究,大大提高了上述三類分子的離子化效率,為質譜高靈敏度檢測提供了解決方案。在MALDI-TOFMS用于非小細胞組織切片直接分析開展了研究工作,建立了用組織成像的方法尋找非小細胞癌生物標志物的方法,發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺鱗癌中發(fā)現(xiàn)有

3、別于癌旁組織的m/z3000-3500的簇峰;發(fā)現(xiàn)非小細胞2種亞型肺鱗癌和肺腺癌相比,有各自特征性的磷脂分子峰出現(xiàn);發(fā)現(xiàn)癌組織中hemeb(m/z616.2)表達量遠低于癌旁組織,成為區(qū)別非小細胞肺癌和癌旁組織的生物標志物。隨著人類基因組序列“全書”的繪制完成,首次在分子層面上為人類揭示生命奧秘提供了一份生命“解剖圖”。此后,人類對生命“密碼”的解讀大大加快了,進入了后基因組時代中。蛋白質組學(Proteomics)研究正是生命科學進入

4、后基因組時代的標志之一。蛋白質組學以蛋白質組(Proteome)為研究對象。蛋白質組最初是指“由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部相應的蛋白質”。測定一個有機體的基因組所表達的全部蛋白質的設想,萌發(fā)在1975年雙向凝膠電泳發(fā)明之時。1994年Williams正式提出了這個問題,而“蛋白質組”的名詞則是由Wilkins創(chuàng)造的,它是由蛋白質的“Protein”和基因組的“Ome”字母拼接而成,發(fā)表在1995年7月的Electrophor

5、esis雜志上?，F(xiàn)在這一概念得到了擴展,指有機體全部基因表達的全部蛋白質及其存在方式,或者說是一種細胞、組織或完整生物體在特定時空上所擁有的全套蛋白質,以及蛋白質表達后的修飾,蛋白質之間的相互作用,蛋白質的空間結構和更高級的復合物等。蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術、蛋白質相互作用分析及生物信息學數(shù)據處理技術被稱為蛋白質組研究的四大基本支撐技術。其中,在蛋白質鑒定方面,質譜技術是目前在鑒定蛋白質的多種方法中發(fā)展最快、應用最廣泛、最具發(fā)展?jié)?/p>

6、力的技術。自約翰.芬恩(JohnB.Ferm)和田中耕一(Koichi.Tanaka)分別發(fā)明了兩種重要的軟電離方式“電噴霧離子化(ESI)”和“基質輔助激光解析離子化(MALDI)”技術,建立對生物大分子進行確認和結構分析的方法以來,質譜目前已經成為生命科學領域最活躍的前沿研究領域之一。蛋白質組學的科學研究之所以能夠取得蓬勃的發(fā)展,主要依賴于質譜技術的飛速發(fā)展以及高通量分離和分析技術的突破性進步。然而,由于蛋白質的可變性和多樣性等特點

7、,蛋白質組研究在分析技術和分析儀器上還有很多瓶頸問題有待解決。如蛋白質的表達水平差異大,動態(tài)范圍寬,現(xiàn)有的分離技術還不足以將一個生物體內所有的蛋白質分離開來:現(xiàn)有分析儀器的靈敏度還很難將體內微量的蛋白質精確分析,而這種微量蛋白在生命過程中起到關鍵性作用。隨著蛋白質組學研究的進一步深入,傳統(tǒng)的生物質譜技術平臺已不足以應對蛋白質組學中高靈敏度高通量高準確度等的檢測要求,所以研究和發(fā)展基于生物質譜的新技術與新方法對于促進蛋白質組學的研究顯得意

8、義重大。本論文以發(fā)展MALDI質譜分析相關的新技術新方法為切入點,開展了相關研究工作。本論文共分為五章,主要內容如下:第一章主要綜述了蛋白質組學研究發(fā)展概況,包括蛋白質組學的研究目的、意義、主要研究方法以及蛋白質組學在人類疾病研究中的應用。質譜儀器作為蛋白質組學研究領域中一個重要的技術支撐,本章節(jié)對質譜儀器的發(fā)展狀況進行了簡單的綜述,包括其核心部件離子源、質量分析器和檢測器技術的發(fā)展狀況。著重對蛋白質組學中應用廣泛的兩種質譜儀器基質輔助

9、激光解析質譜和電噴霧質譜的原理和應用進行了小結。本章還對蛋白質組學分析時面臨的挑戰(zhàn)進行了歸納,對MALDI技術研究的重要性和面臨的挑戰(zhàn)進行分析,并在此基礎上提出了本課題工作的研究方向。第二章研究工作主要為嵌段共聚物PSF-b-PEO用于痕量多肽靶上除鹽和富集后直接MALDI-TOFMS分析的新方法研究。我們選擇微觀相分離結構的嵌段共聚物PSF-b-PEO作為MALDI靶涂層,然后利用制作的聚合物涂層進行痕量多肽的靶上除鹽和富集工作。嵌段

10、共聚物結構中具有親水和疏水的兩端,在點覆樣品溶液后,由于疏水端不溶解在樣品溶劑中,保持嵌段聚合物在金屬上的膜穩(wěn)定性;親水端則可以溶解在樣品溶劑中并對鹽和一些污染物具有強的吸附作用,因而在樣品溶劑揮發(fā)的過程中,鹽和其它污染物被牢牢地包裹在聚合物內部。點覆基質溶液后,由于鹽被包裹在聚合物內部,不再進入到基質的溶劑中,而肽段會再次溶解在基質中并和基質形成結晶。并且,由于聚合物膜的疏水性使得樣品會收縮在一個很小的靶點區(qū)域內,使樣品在靶上得到了富

11、集。因此無需額外清洗除鹽,富集除鹽后的樣品就可以直接進行MALDI-TOFMS分析。第三章的研究工作主要為以樹枝狀聚合物-碳納米管為基體,將胰蛋白酶固定在樹枝狀聚合物的表面得到可溶性的固定化酶,成功實現(xiàn)了痕量蛋白質在靶板上快速酶解后直接用于MALDI-TOFMS分析。我們首先在混合酸中對碳納米管進行酸化處理在表面形成大量羧基并通過酸化處理截短碳納米管以及去除雜質。然后將聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(dendrimers)通過共價結合的方式結

12、合在碳納米管表面,并將胰蛋白酶通過戊二醛交聯(lián)反應固定在聚合物的氨基端。碳納米管表面修飾了dendrimers后,極大地增強了碳納米管的可溶性。因此,以樹枝狀聚合物-碳納米管為基體的固定化酶既具有固定化酶的穩(wěn)定性高的優(yōu)點又具有可溶性酶活性高的優(yōu)點,并且由于它的可溶性,酶解后不需要將碳納米管從溶液中分離即可進行質譜鑒定。以樹枝狀聚合物-碳納米管為基體的固定化胰蛋白酶進行靶上酶解,效率高、速度快、酶自降解峰少,酶解完成后可以直接進行質譜檢測,

13、特別適合痕量蛋白質的酶解和鑒定。第四章研究工作主要為針對提高磷酸化多肽、寡聚糖及磷脂離子化效率開展的MALDI基質體系研究。通過在基質溶液中添加磷酸銨鹽提高磷酸化肽的離子化效率;合成了新型離子基質2,3,4-三羥基苯乙酮/N,N-二甲基苯胺(2,3,4-THAP/DMA),2,3,4-三羥基苯乙酮/吡啶(2,3,4-THAP/Py),2,4,6-三羥基苯乙酮/N,N-二甲基苯胺(2,4,6-THAP/DMA)和2,4,6-三羥基苯乙酮/

14、吡啶(2,4,6-THAP/Py)提高寡聚糖離子化效率;此外,還擴展了非極性基質[2E-3-(4-叔-丁基苯基)-2-甲基丙-2-亞烯基]丙二腈(DCTB)的應用范圍,發(fā)現(xiàn)其在提高磷脂離子化效率方面有著重要的貢獻。大大提高了上述三類分子的離子化效率,為質譜高靈敏度檢測提供了解決方案第五章研究工作主要為MALDI質譜成像技術用于非小細胞肺癌組織切片分析的研究。MALDI質譜成像技術用于直接分析組織切片已在基礎與臨床醫(yī)學研究中迅速發(fā)展。通過

15、對冰凍組織切片表面的質譜掃描可以快速直觀地得到組織中的分子如蛋白,多肽等的分布信息。我們采用質譜成像技術對人的非小細胞肺癌組織切片及癌旁組織切片進行了研究,對質譜直接組織表面分析的方法進行了優(yōu)化,初步建立了以質譜成像法尋找非小細胞肺癌中的生物標志物的方法。結果表明,肺鱗癌組織中有m/z3000-3500范圍內的特征性簇峰出現(xiàn);發(fā)現(xiàn)非小細胞2種亞型肺鱗癌和肺腺癌相比,有各自特征性的磷脂分子峰出現(xiàn);以及在肺癌組織中hemeb表達量遠低于癌旁