1、胞苷是化學(xué)合成多種抗病毒、抗腫瘤藥物的中間體，有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文對(duì)產(chǎn)胞苷枯草芽孢桿菌的基因工程育種，進(jìn)行了初步研究。
　　本研究以枯草芽孢桿菌168為出發(fā)菌株，在其染色體araR基因位點(diǎn)，引入了一個(gè)受AraR蛋白調(diào)控的新霉素抗性基因構(gòu)成的反向選擇盒，構(gòu)建了菌株ZY10N，用作無標(biāo)記基因修飾，構(gòu)建產(chǎn)胞苷基因工程菌的出發(fā)菌株。
　　在ZY10N菌株中，敲除了胞苷脫氨酶基因（cdd），構(gòu)建了菌株ZY11C。然后分別以cdd、h

2、om、pyrR基因缺失和prs基因強(qiáng)表達(dá)菌株ZY41PRS，cdd、hom、pyrR、pdp-nupC基因缺失和prs基因強(qiáng)表達(dá)菌株ZY51PRS為出發(fā)菌，以pyrG基因組成型表達(dá)為目的，修飾了其轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，獲得了pyrG基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、前導(dǎo)區(qū)和編碼序列發(fā)生不同點(diǎn)突變的重組菌株ZY42G3、ZY42G9、ZY42G12、ZY52G3和ZY52G9。搖瓶培養(yǎng)顯示，出發(fā)菌的最大生長OD值為9.38，ZY42G系菌株的最大生長OD值分別為8

3、.72、7.2、10.84，表明pyrG基因表達(dá)狀態(tài)改變會(huì)影響菌株生長能力。ZY42G系菌株分別產(chǎn)胞苷42.6μg/mL、56.6μg/mL、33.4μg/mL，比出發(fā)菌分別提高了63.8％、117.7%、28.5%。尿嘧啶產(chǎn)量分別為533.4μg/mL、439.1μg/mL、314.4μg/mL；尿苷最大產(chǎn)量出現(xiàn)在發(fā)酵20-30h，產(chǎn)量分別為25.9μg/mL、26.3μg/mL、23.5μg/mL。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)點(diǎn)突變改變了p

4、yrG基因表達(dá)狀態(tài)，編碼序列的點(diǎn)突變改變了CTP合成酶的活性，胞苷產(chǎn)量與pyrG基因表達(dá)狀態(tài)和CTP合成酶的活性有相關(guān)性。ZY52G系菌株搖瓶發(fā)酵顯示，其生長能力沒有顯著變化；在發(fā)酵液中均未檢測(cè)到尿嘧啶；胞苷產(chǎn)量均為27μg/mL左右，較出發(fā)菌下降44%。尿苷產(chǎn)量均為600μg/mL左右，較出發(fā)菌下降約33%。這一結(jié)果表明，在pdp-nupC基因缺陷背景下，改變pyrG基因的表達(dá)狀態(tài)不利于嘧啶核苷的過量合成。
　　為了構(gòu)建pyrG