本實驗室在基因工程葡激酶(Sak)研究的基礎上，構建了新型葡激酶突變體(RGD—Sak，DGR)，它不但保持了野生型葡激酶的溶栓活性，而且具有明顯的抗血小板聚集的功能，動物實驗證實了DGR具有溶栓和抗栓等藥理學效用。此外，與野生型Sak相比，DGR在豚鼠體內的免疫原性明顯下降。在此基礎上，我們進行了DGR中試規(guī)模的表達與純化工藝研究。DGR免疫原性低，有望成為預防血栓性疾病的藥物。但是，DGR與Sak一樣，分子量小，體內半衰期短，靜脈用藥不宜于作為預防性藥物。緩釋微球載藥系統(tǒng)可克服這一缺點。因此，研究具有緩釋功能的DGR微球制劑具有重要應用價值，我們首次研制了葡激酶突變體緩釋微球制劑。 利用DGR工程菌在30L發(fā)酵罐中，高效表達DGR，表達產物約占菌體總蛋白的50％。離心收集菌體，用高壓勻漿法破碎菌體，離心后上清用硫酸銨分級沉淀，沉淀的蛋白溶解后經凝膠過濾和陰離子交換純化，得到高純度、高活性的DGR半成品。加入輔劑、無菌過濾、分裝和冷凍干燥后得成品。純化后的產品純度經SDS—PAGE、LC-MS、等電聚焦分析，純度在98％以上，比活性為1．2×105AU／mg，每升發(fā)酵液可獲得DGR220mg，純化活性收率在45％以上。中試工藝具有操作簡便、穩(wěn)定、回收率高的優(yōu)點，易于放大至生產規(guī)模。我們初步建立了中試產品的制造和檢定規(guī)程。 使用復乳溶劑揮發(fā)法制備了含DGR的PLGA微球，研究了攪拌速度、PLGA濃度、內水相和外水相中的添加劑對蛋白包封率以及微球性質的影響。并進行了DGR微球的體外和體內釋放試驗。為了提高DGR在包封過程中的穩(wěn)定性，研究了DGR水溶液與二氯甲烷形成乳液時，吐溫一80、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖和聚乙烯醇(PVA)對DGR穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)吐溫一80、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖均不能提高DGR的回收率；只有PVA有效抑制超聲乳化時DGR在水／二氯甲烷界面上的變性，使DGR的活性回收率從16％提高到幾乎90％以上，并且PVA對DGR的保護作用呈現(xiàn)量效關系。在外水相中加入NaCl可以顯著提高蛋白包封率，同時使微球表面的孔洞變小，微球內DGR的分布更加均勻。DGR微球的體內、外釋放呈現(xiàn)兩個時相，即突釋期和隨后的緩釋期，DGR體外以活性形式釋放可達到15天以上；肌肉注射微球后，DGR在兔體內緩釋釋放達到5天以上。我們的試驗結果表明，PLGA微球是DGR的良好載藥系統(tǒng)。 DGR從微球中的釋放不完全，我們對PLGA微球釋放過程中造成DGR變性聚集的因素進行了分析發(fā)現(xiàn)，PLGA降解產物產生的微球內酸性微環(huán)境會導致DGR的變性聚集。內水相中加入Mg(OH)2可減少DGR變性，提高DGR穩(wěn)定性。此外PLGA的表面吸附也是DGR釋放不完全的重要原因。 用傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)定量研究了PLGA微球內DGR的二級結構。將可增強分辨率的傅里葉去卷積技術與高斯曲線擬合技術共同用于微球內DGR酰胺工帶的定量分析，發(fā)現(xiàn)DGR酰胺I帶共包含九個紅外吸收峰，并對各組份進行了歸屬，還對微球內DGR結構穩(wěn)定性相關的1623和1650cm-~吸收峰進行了討論。