1、本文擬采用免疫熒光技術(shù)、激光共聚焦顯微技術(shù)及內(nèi)臟敏感性的測定等方法闡明HCN2通道、NR2B共同參與PTSD狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性—中樞敏化形成的機制，及ZD7288、CTX通過下調(diào)HCN2的表達發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性效應(yīng)，為臨床上防治PTSD相關(guān)疾病提供新方法。
　　第一部分 PTSD狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性改變及HCN2阻斷劑ZD7288的抗內(nèi)臟傷害性刺激效應(yīng)
　　目的:
　　研究PTSD誘導(dǎo)的內(nèi)臟敏感性的改變及HCN2阻斷劑ZD72

2、88的抗內(nèi)臟傷害性刺激效應(yīng)。
　　方法:
　　1)實驗動物及分組:隨機選取清潔成年SD(sprague-dawley rats，SD)雌性大鼠22只，體重約150～200g，將大鼠隨機分為3組:即正常對照組（7只）、PTSD組(8只)和PTSD+ZD7288組（7只）。正常對照組:不予任何處理正常飼養(yǎng);PTSD組:采用連續(xù)單一應(yīng)激(single-prolonged stress model，SPS)聯(lián)合電擊刺激(1mA，持續(xù)

3、4s)的方法制備PTSD內(nèi)臟高敏感大鼠模型，術(shù)后7天進行實驗;PTSD+ZD7288組:在建立PTSD大鼠模型的基礎(chǔ)上，給予鞘內(nèi)注射HCH2的阻斷劑ZD7288(100 nmol/L)，2h后開始實驗。
　　2) PTSD狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性的檢測:采用結(jié)直腸擴張(colorectal distention，CRD)引起內(nèi)臟運動反射(visceromotor reflex，VMR)的方法檢測大鼠內(nèi)臟敏感性改變，并觀察HCN2阻斷劑ZD

4、7288的抗內(nèi)臟傷害性刺激效應(yīng)。采用SPIKE2軟件分析腹外斜肌的放電活動，即計算出肌電圖（electromyogram，EMG）的平均曲線下面積(area underthe curve，AUC)，AUC值代表內(nèi)臟敏感性的高低。
　　結(jié)果:
　　與正常組比較，在40mmHg壓力下行CRD時，PTSD組AUC明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.6200±0.0278 vs.0.3786±0.0155，P＜0.001）;在

5、60mmHg壓力下行CRD時，PTSD組AUC明顯亦高于正常對照組(0.7663±0.0262 vs.0.5271±0.0212，P＜0.001)。在20、40、60mmHg壓力下行CRD時，PTSD+ZD7288組AUC較PTSD組顯著降低，P值均有統(tǒng)計學(xué)差異(0.2180±0.0159 vs.0.2913±0.0229，P=0.005)、（0.4618±0.0157 vs.0.6200±0.0278，P＜0.001）、(0.6023

6、±0.0173 vs.0.7663±0.0262,P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　采用SPS聯(lián)合足底電擊的方法可成功建立PTSD內(nèi)臟高敏感大鼠模型，PTSD可誘導(dǎo)慢性的內(nèi)臟高敏感性—中樞敏化狀態(tài)的形成;鞘內(nèi)注射HCN2的阻斷劑ZD7288有明顯的抗內(nèi)臟傷害性刺激的效應(yīng)。
　　第二部分 在PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下脊髓和大腦HCN2表達的改變
　　目的:
　　研究PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下胸髓、腰髓、海馬和前

7、額葉皮層HCN2表達的改變。
　　方法:
　　1)實驗動物及分組:選用清潔級成年雌性SD大鼠共14只，體重約150～200 g。將大鼠隨機分為2組:即正常對照組和PTSD組，每組各7只。正常對照組無任何處理正常飼養(yǎng);PTSD組，根據(jù)前述方法建立PTSD模型。
　　2)采用免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)研究HCN2在腰髓、胸髓、海馬和前額葉皮層表達的改變。采用Image-Pro Plus6.0分析軟件計算HCN2表達的平均光密

8、度值(average optical density, AOD)。
　　結(jié)果:
　　1)PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下HCN2在腰髓水平的表達
　　采用免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):在PTSD內(nèi)臟高敏感模型組，HCN2集中分布于脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)?，在前角亦有少量表達，其HCN2表達的AOD值較正常對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（121.12±4.85 vs.78.05±6.49，P＜0.001）。
　　2)PTSD

9、內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下HCN2在胸髓水平的表達
　　采用免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):在PTSD內(nèi)臟高敏感模型組，HCN2亦主要分布于脊髓背角Ⅰ-Ⅱ?qū)樱谇敖且嘤猩倭勘磉_，其HCN2表達的AOD值較正常對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（124.44±4.63 vs.70.13±5.46，P＜0.001）。
　　3)PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下HCN2在海馬水平的表達
　　采用免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):在PTSD內(nèi)臟高

10、敏感模型組，HCN2在海馬神經(jīng)元有大量表達，呈密集分布的綠色熒光。與正常對照組比較，其HCN2的AOD值顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（95.49±4.64 vs.65.36±4.34，P＜0.01）。
　　4)PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下HCN2在前額葉皮層的表達
　　采用免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):在PTSD內(nèi)臟高敏感模型組，HCN2在前額葉皮層有大量表達，其AOD值較正常對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(122.39±4

11、.33 vs.96.28±5.78, P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　在PTSD狀態(tài)下，在脊髓和大腦水平HCN2的表達明顯上調(diào)。在中樞水平HCN2介導(dǎo)了PTSD內(nèi)臟高敏感-中樞敏化形成的分子機制。
　　第三部分 PTSD狀態(tài)下CTX通過影響HCN2的表達發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性效應(yīng)的作用及機制
　　目的:
　　PTSD狀態(tài)下β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉(ceftriaxone，CTX)對脊髓HCN2表達的影響及

12、CTX下調(diào)HCN2表達的抗傷害性效應(yīng)。
　　方法:
　　1)實驗動物及分組:選用清潔級成年雌性SD大鼠共44只，體重約150～200 g，將大鼠分為三組:正常對照組(14只);PTSD組（15只），PTSD+CTX組（15只）。其中，每組各取7只用于免疫熒光及激光共聚焦顯微技術(shù)研究，其余大鼠用于內(nèi)臟敏感性的測定。正常對照組無任何處理正常飼養(yǎng);PTSD組，根據(jù)前述方法建立PTSD模型;PTSD+CTX組在PTSD術(shù)后，連續(xù)7d

13、給予CTX腹腔注射（200 mg/kg）。
　　2)采用CRD-VMR檢測大鼠內(nèi)臟敏感性改變
　　3)采用免疫熒光及激光共聚焦顯微技術(shù)研究脊髓水平CTX對HCN2表達的影響。
　　結(jié)果:
　　與PTSD組比較，在20mmHg壓力下行CRD時，PTSD+CTX組AUC明顯降低（0.2175±0.0090 vs.0.2913±0.0229，P=0.005）;在40mmHg壓力下行CRD時，PTSD+CTX組AUC顯著

14、降低（0.5038±0.0336 vs.0.6200±0.0278，P=0.006）;在60mmHg壓力下行CRD時，PTSD+CTX組AUC亦較PTSD組顯著降低（0.6400±0.0245 vs.0.7663±0.0262，P=0.001）。免疫熒光結(jié)果顯示:與PTSD組比較，在腰髓水平PTSD+CTX組HCN2表達明顯減少，其AOD值顯著降低(98.24±5.86 vs.121.12±4.85，P=0.012)。
　　結(jié)論:

15、
　　在內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下CTX可明顯下調(diào)HCN2的表達，CTX可通過影響HCN2的表達發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性作用。
　　第四部分 在PTSD狀態(tài)下HCN2與NR2B在脊髓和海馬共表達協(xié)同調(diào)控內(nèi)臟高敏感性的機制
　　目的:
　　研究PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下HCN2與NR2B在脊髓和海馬的共同表達的改變。
　　方法:
　　1)實驗動物及分組:選用清潔級成年雌性SD大鼠共13只，體重約150～200 g。將大鼠隨

16、機分為2組:即正常對照組（6只）和PTSD組（7只）。正常對照組無任何處理正常飼養(yǎng);PTSD組，根據(jù)前述方法建立PTSD模型。
　　2)采用免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)研究HCN2與NR2B在脊髓和海馬的共同表達的改變。采用Image-Pro Plus6.0分析軟件計算HCN2表達的AOD值。
　　結(jié)果:
　　1)HCN2與NR2B在大鼠脊髓的共同表達
　　觀察比較HCN2、NR2B在對照組與PTSD組大鼠脊髓的共同

17、表達，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表示，HCN2、NR2B在PTSD組大鼠脊髓表達的AOD值均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（119.83±3.13 vs.79.33±3.52，P＜0.01）與（90.83±4.35 vs.64.83±3.40，P＜0.01）。
　　2)HCN2與NR2B在大鼠海馬的共同表達
　　觀察比較HCN2、NR2B在對照組與PTSD組大鼠海馬的共同表達，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表示，HCN2、NR2B在PTSD組大鼠海馬