1、乳腺癌是女性易發(fā)的惡性腫瘤之一，也是造成女性死亡的主要原因。據統(tǒng)計，2012年世界范圍內新發(fā)病例大約170萬，而其中死亡病例就已接近50萬[1]。來自中國抗癌協會的統(tǒng)計數字顯示，目前我國乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的速度遞增，且呈現年輕化的趨勢，而且逐漸成為城市中死亡率增長最快的癌癥。因此，為降低乳腺癌患者的死亡率，不僅僅是要早期治療，更重要的是有效防止其惡性進展。
　　乳腺癌是起源于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，原位乳腺癌并不致命，如果

2、能夠做到早期發(fā)現、早期診斷及早期治療，乳腺癌或可成為療效最佳的實體腫瘤之一。但乳腺癌的早期癥狀往往并不明顯，這就使很多患者錯失最佳治療時機，乳腺癌細胞一旦脫離原發(fā)病灶，極易通過血液或淋巴液進行播散，形成遠處轉移，嚴重影響乳腺癌患者的生存質量和生存率。
　　糖鏈與細胞膜的蛋白質、脂質相連，幾乎覆蓋細胞膜的整個外表面[2]，它決定了細胞的“面部特征”。唾液酸化修飾是以單磷酸胞苷活化的唾液酸（CMP-Neu5Ac）為底物，經唾液酸糖基轉

3、移酶（sialyltransferase，ST）催化，將底物中的唾液酸殘基（Neu5Ac）轉移到細胞膜糖蛋白或糖脂末端的過程。唾液酸殘基（Neu5Ac）以糖苷鍵連接到糖蛋白或糖脂的糖鏈末端，根據形成的糖苷鍵類型的不同，可以將唾液酸糖基轉移酶家族分成四大類，共20種亞型。第一類，以α-2,3糖苷鍵將唾液酸殘基連接到糖鏈末端的半乳糖上，共6種亞型，包括ST3Gal1-6；第二類，以α-2,6糖苷鍵將唾液酸殘基連接到糖鏈末端的半乳糖上，共2種

4、亞型，包括ST6Gal1-2；第三類，以α-2,6糖苷鍵將唾液酸殘基連接到糖鏈末端的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）上，共6種亞型，包括ST6GalNAc1-6；第四類，以α-2,8糖苷鍵將唾液酸殘基連接到其他唾液酸（Sia）上，共6種亞型，包括ST8SIA1-6[3]。唾液酸糖基轉移酶結構和功能的改變可以直接影響細胞膜糖蛋白和糖脂的唾液酸化糖基化的結構和功能，進而影響細胞的生物學行為。
　　唾液酸化修飾是蛋白質糖基化的一種。細胞

5、表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修飾廣泛存在，并且在細胞粘附、抗原識別和信號傳導等[4]多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。而唾液酸糖基轉移酶的表達及活性的改變，可以直接影響糖鏈的結構和功能。而糖鏈結構和功能的改變往往與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。隨著對腫瘤分子生物學和腫瘤免疫學研究的深入，越來越多的證據表明，唾液酸化修飾與惡性腫瘤在其增殖、遷移和侵襲以及逃避機體免疫監(jiān)視等方面都具有十分重要的作用，唾液酸化修飾的糖鏈被認為是一種新型的、

6、廣譜的腫瘤標志物[5]。
　　大量研究表明，唾液酸糖基轉移酶在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用。如：ST3GAL2的過表達與乳腺癌病人臨床化療療效密切相關[6]。下調ST6GAL1的表達，可抑制乳腺癌細胞的轉移能力[7]。ST6GALNAC1的過表達，可增強乳腺癌細胞的成瘤性[8]。ST6GALNAC5在乳腺癌細胞中的過表達，可增強其對大腦內皮細胞的粘附，從而誘發(fā)乳腺癌腦轉移[9]。ST8SIA1在雌激素受體陰性乳腺癌的不同

7、亞型中呈現高表達[10]。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度大約為19-24個核苷酸的、單鏈非編碼的內源性小分子RNA，其基因序列高度保守，在細胞內參與轉錄后基因的調控。miRNAs通過與靶基因mRNA完全性或不完全性的互補結合，使靶基因mRNA斷裂降解或抑制其翻譯，從而達到調控靶基因表達的目的。miRNAs的異常表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中同樣扮演著關鍵性的角色。有研究證實，miR-147，miR-340

8、和 miR-1296的異常表達可調控乳腺癌細胞的增殖、凋亡以及轉移[11-13]；miR-139-5p能夠抑制乳腺癌細胞的增殖，而miR-217的過表達可增強乳腺癌細胞的侵襲能力[14]。
　　近來發(fā)現，miR-26家族由4個序列相似、結構相仿、種子區(qū)序列（UCAAUGA）相同的miRNAs組成，該家族成員主要有miR-26a，miR-26b，miR-1297和miR-4465。包括乳腺癌、肝癌、胃癌在內的多種實體腫瘤，與相應的癌

9、旁組織相比，均可見miR-26a/b低表達，并且與腫瘤的預后、療效、淋巴結轉移以及臨床分期等都存在一定的相關性[15]。然而，關于miR-26a/b是否存在對唾液酸糖基轉移酶mRNA的靶向調控作用，以及該靶向調控作用如何影響乳腺癌細胞的增殖和侵襲，尚未見相關報道。
　　本研究中，通過分析乳腺癌組織及乳腺癌細胞株膜蛋白唾液酸化N-糖鏈的組成，揭示了唾液酸化與乳腺癌進展的相關性，同時也提供了miRNA調控唾液酸化的新證據。質譜分析表明

10、，與癌旁組織及正常乳腺上皮細胞株MCF-10A相比，在乳腺癌組織及乳腺癌細胞株MDA-MB-231中，膜蛋白N-糖鏈的唾液酸化水平顯著增高。我們對20種唾液酸糖基轉移酶基因進行分析發(fā)現，在乳腺癌和癌旁組織中存在顯著性差異；在具有不同轉移潛能的乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7，和正常乳腺上皮細胞MCF-10A間同樣存在顯著性差異。其中ST8SIA4在乳腺癌組織以及具有高度轉移潛能的乳腺癌細胞株MDA-MB-231中明顯高表達。

11、敲除乳腺癌細胞的ST8SIA4可以明顯抑制其惡性行為，尤其是可以抑制唾液酸糖基轉移酶依賴性的細胞增殖和侵襲。通過生物信息學技術，對 miRNA的靶點ST8SIA43'-UTR端進行預測，可以確定ST8SIA4是miR-26a/26b的靶基因之一。進一步的實驗數據顯示，在乳腺癌細胞株、乳腺癌組織及癌旁組織中，ST8SIA4和miR-26a/26b的表達呈負相關。通過雙熒光素酶報告分析方法可以發(fā)現，miR-26a/26b通過與ST8SIA4

12、的3'-UTR的特異性結合，對其進行調控。我們通過轉染miR-26a/26b模擬物或抑制物來改變乳腺癌細胞ST8SIA4的表達，發(fā)現過表達miR-26a/26b可以降低乳腺癌細胞ST8SIA4的表達水平并且可以影響乳腺癌進展。這些結果顯示，唾液酸糖基化水平的改變可以作為乳腺癌進展的有效標志，此外，miR-26a/26b可以通過靶向作用ST8SIA4廣泛參與對唾液酸糖基化機制的調控。
　　第一部分質譜分析乳腺癌組織和細胞株表面N-糖

13、鏈的組成差異
　　目的：
　　通過質譜分析乳腺癌組織、癌旁組織、乳腺癌細胞株（MDA-MB-231）、人乳腺上皮細胞株（MCF-10A）細胞表面N-糖鏈的組成，發(fā)現差異表達的N-糖鏈以及唾液酸化的N-糖鏈。
　　方法：
　　提取組織和細胞株的膜蛋白，并制備甲基化N-糖鏈。使用MALDI-TOF質譜儀，應用FlexControl3.4軟件系統(tǒng)（Bruker-Daltonics，Germany）分析乳腺癌組織與癌旁組

14、織、MDA-MB-231與MCF-10A之間膜蛋白N-糖鏈的差異。
　　結果：
　?。?）在乳腺癌組織和癌旁組織中共有32種N-糖鏈的表達，信號峰3,5,6,7,11,12,14,15,16,28,35和36只在乳腺癌組織中表達，其中信號峰35為唾液酸化N-糖鏈（Figure1B，Table4）。另外，與癌旁組織相比，信號峰13,17,18,23,32和33在乳腺癌組織中見顯著增強（>2 fold），其中23和32為唾液酸化

15、N-糖鏈（Figure1B，Table4）。
　?。?）在MDA-MB-231和MCF-10A中共有33種N-糖鏈的表達，信號峰22,29,37和40只在MDA-MB-231特異性地表達，且和唾液酸化密切相關。除此之外，與MCF-10A相比，信號峰1,4,5,10,11,15,16,18,21,25,26,27,31,32,33,34,35,38和39（>2 folds）在MDA-MB-231中顯著增強（Figure2B），其中信

16、號峰25,27,32,33,34,35,38和39與唾液酸化密切相關（Table4）。
　　結論：
　?。?）乳腺癌組織和癌旁組織的膜蛋白N-糖鏈的組成存在明顯差異，且差異表達的N-糖鏈與唾液酸化密切相關。
　?。?） MDA-MB-231和MCF-10A細胞膜蛋白N-糖鏈的組成存在明顯差異，且差異表達的N-糖鏈與唾液酸化密切相關。
　?。?）以上結論表明，唾液酸化的N-糖鏈異常表達與乳腺癌的發(fā)展密切相關。

17、>　　第二部分實時熒光定量PCR檢測組織和細胞株唾液酸糖基轉移酶(ST)基因mRNA的表達及ST8SIA4在組織及細胞株中蛋白的表達
　　目的：
　　通過檢測乳腺癌組織與癌旁組織、乳腺癌細胞株（MDA-MB-231、MCF-7）與人乳腺上皮細胞株（MCF-10A）ST基因家族mRNA的表達，發(fā)現差異表達明顯的唾液酸糖基轉移酶。
　　方法：
　　通過實時熒光定量PCR技術篩選出MDA-MB-231、MCF-7及MC

18、F-10A間，乳腺癌組織及癌旁組織間差異表達明顯的ST基因；并通過免疫組織化學染色和western-blot技術對篩選出的差異表達ST進行驗證。
　　結果：
　?。?） ST6GALNAC5(2.31 folds)，ST8SIA3(1.78 folds)和ST8SIA4(2.47 folds) mRNA在乳腺癌組織中高表達(Figure3B，C)。
　?。?）與正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比，ST6GALNAC5(

19、7.33 folds)，ST8SIA4(14.81 folds)和ST8SIA5(3.11 folds) mRNA在MDA-MB-231細胞中的表達明顯增高(Figure4B，C)；與侵襲性較弱的乳腺癌細胞系MCF-7相比，ST3GAL6(12.34 folds)和 ST8SIA4(5.71 folds) mRNA在 MDA-MB-231細胞中的表達明顯上調(Figure4A，C)。
　?。?）免疫組織化學染色顯示，與癌旁組織相比

20、，ST8SIA4在乳腺癌組織中呈現高表達（Figure5A）。免疫熒光染色顯示，與 MCF-7相比，ST8SIA4在MDA-MB-231細胞中呈現高表達（Figure5A）。
　?。?）Western blot結果顯示，與低轉移潛能MCF-7細胞相比，ST8SIA4蛋白在MDA-MB-231細胞中呈現高表達（Figure5B）。
　　結論：
　　ST8SIA4在MDA-MB-231中表達明顯升高，在MCF-7和MCF-

21、10A中輕度表達，其差異表達最為顯著。ST8SIA4在乳腺癌組織和癌旁組織中差異表達最為明顯。這表明，唾液酸糖基轉移酶ST8SIA4可能與乳腺癌的惡性進展相關。
　　第三部分特異性下調MDA-MB-231細胞中的ST8SIA4的表達，觀察其對乳腺癌細胞體外的增殖和侵襲能力、體內成瘤性的影響
　　目的：
　　特異性下調MDA-MB-231細胞中高表達的ST8SIA4，檢測ST8SIA4下調后的MDA-MB-231細胞在體

22、外增殖和侵襲能力以及在小鼠體內成瘤能力的變化。
　　方法：
　　沉默MDA-MB-231細胞中的ST8SIA4基因后，采用CCK-8細胞增殖實驗、劃痕試驗、transwell試驗及體內成瘤試驗，檢測其體外增殖能力和侵襲能力以及體內成瘤能力的變化。
　　結果：
　　（1）與轉染control shRNA相比，轉染ST8SIA4 shRNA的MDA-MB-231細胞中的ST8SIA4的蛋白水平明顯降低，且具有顯著性差

23、異（Figure6，*P<0.05）。
　?。?）CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，沉默ST8SIA4基因的MDA-MB-231細胞的體外增殖受到明顯抑制(Figure7)。劃痕試驗和transwell實驗結果顯示，與對照組相比，特異性下調MDA-MB-231細胞中的ST8SIA4后，細胞體外遷移、侵襲能力均明顯下降（Figure8A，B）。
　　（3）體內成瘤試驗顯示，與對照組相比，注射ST8SIA4 shRNA細胞的小鼠成

24、瘤體積明顯減?。‵igure9，*P<0.05）。
　　結論：
　　特異性下調MDA-MB-231細胞中ST8SIA4后，該細胞體外增殖受抑、侵襲能力明顯下降。小鼠體內成瘤實驗中，平均成瘤體積明顯低于對照組。
　　第四部分 miR-26a和miR-26b對ST8SIA4靶向調控作用
　　目的：
　　通過檢測組織和細胞株中miR-26a/26b的表達，分析其與ST8SIA4表達的潛在相關性。
　　方法：

25、
　　定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）技術分析乳腺癌組織及癌旁組織中，MDA-MB-231、MCF-7及MCF-10A的miR-26a和miR-26b的表達情況。采用qRT-PCR分析乳腺癌組織、癌旁組織的ST8SIA4 mRNA與miR-26a/26b表達水平及相關性。特異性上調MDA-MB-231中的miR-26a/26b、下調MCF-7中的miR-26a/26b，檢測過表達、干擾前后，細胞中ST8SIA4的mRNA及其蛋白

26、表達情況。采用雙熒光素酶實驗驗證miR-26a/26b對ST8SIA4的靶向調控功能。
　　結果：
　　（1）qRT-PCR結果顯示，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中miR-26a/26b的表達水平明顯下降（Figure10A）。與MCF-7和MCF-10A相比，MDA-MB-231細胞的miR-26a/26b表達水平明顯下降（Figure10B）。且在乳腺癌組織和癌旁組織中，ST8SIA4 mRNA的表達水平與miR-26a/

27、26b的表達水平呈負相關（Figure11），在乳腺癌細胞株中的表現亦如此。
　　（2）特異性上調MDA-MB-231中的miR-26a/26b的后，ST8SIA4的mRNA及其蛋白表達水平明顯下降（Figure12A，B）。特異性下調MCF-7中的miR-26a/26b的后，ST8SIA4的mRNA及蛋白表達水平明顯升高（Figure12C，D）。
　?。?）雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與對照組相比，ST8SIA4WT

28、3’-UTR+ miR-26a/26b mimic組熒光素酶活性顯著降低，而 ST8SIA4MUT3’-UTR+miR-26a/26b mimic組熒光素酶活性沒有明顯變化（Figure13）。
　　結論：
　　ST8SIA4為miR-26a和miR-26b的靶基因。miR-26a和miR-26b通過與ST8SIA4的3′UTR結合，靶向調控ST8SIA4，使其表達水平下調。
　　第五部分 miR-26a/26b靶向調

29、控 ST8SIA4的表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響
　　目的：
　　通過特異性上調及下調miR-26a/26b在乳腺癌細胞株MDA-MB-231及MCF-7中的表達，觀察過表達、干擾前后，miR-26a/26b對乳腺癌細胞體外增殖和侵襲能力的影響；調控ST8SIA4的表達，分析miR-26a/26b對乳腺癌細胞體外增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：
　　將miR-26a/26b mimic和miR-26a/

30、26b inhibitor分別轉染至MDA-MB-231和MCF-7細胞后，特異性上調MDA-MB-231中的miR-26a/26b、下調MCF-7中的miR-26a/26b表達，采用CCK-8細胞增殖實驗、劃痕試驗和transwell實驗，檢測過表達、干擾前后，乳腺癌細胞體外增殖能力和侵襲能力變化。
　　結果：
　?。?）與轉染NC mimic相比，特異性上調MDA-MB-231中的miR-26a/26b后，免疫熒光結果顯

31、示，ST8SIA4表達明顯減低（Figure15A）。CCK-8增殖實驗結果顯示，細胞增殖能力明顯下降（Figure16）；劃痕實驗和transwell實驗結果顯示，細胞遷移、侵襲能力明顯下降（Figure17A，B）。其次，ST8SIA4的過表達能夠明顯的逆轉miR-26a/26b對細胞侵襲的抑制（Figure19）。
　　(2)與轉染NC inhibitor相比，特異性下調MCF-7中的miR-26a/26b后，免疫熒光結果顯

32、示，ST8SIA4表達明顯增強（Figure21A，B）。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，其細胞增殖能力明顯提高（Figure22）；劃痕實驗和transwell實驗結果顯示，細胞遷移、侵襲能力明顯增強（Figure23A）。其次，ST8SIA4的敲除能夠明顯逆轉miR-26a/26b inhibitor對細胞侵襲的促進作用（Figure25）。
　　結論：
　?。?）過表達miR-26a/26b能夠抑制乳腺癌細胞的増殖、遷