1、第一部分重組腺病毒BMP9，BMP13的擴增及分別轉染C3H10T1/2細胞
　　目的:利用重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP的病毒原液分別轉染HEK293細胞從而反復擴增獲得高滴度的重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP，利用AdEasy-BMP9，AdEasy-BMP13，AdEasy-BMPGFP轉染C3H10T1/2細胞使其分別過表達BMP9和BMP13基因。并以新生C3H小鼠的原代心肌細胞作為實驗陽性對照，未處理的C

2、3H10T1/2細胞作為空白組。
　　方法:利用HEK293細胞反復擴增獲得高滴度的重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP。以C3H新生小鼠(1-3d)原代培養(yǎng)心肌細胞作為實驗陽性對照。復蘇后傳代培養(yǎng)的C3H10T1/2細胞于倒置顯微鏡下觀察，當觀察到視野中的細胞生長融合達70％左右時，將AdEasy-BMP9，AdEasy-BMP13，AdEasy-GFP加入培養(yǎng)基中轉染C3H10T1/2細胞，利用熒光顯微鏡下估算和流式細胞技術

3、直接檢測兩種方法明確各腺病毒轉染組細胞的轉染效率，并利用實時熒光定量PCR測定各組細胞中BMP9，BMP13的表達情況。
　　結果:
　　1.經(jīng)過HEK293細胞反復擴增，獲得了后續(xù)試驗用于轉染C3H10T1/2細胞的高滴度重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP。
　　2.利用C3H新生小鼠(1-3d)心肌細胞分離純化進行原代培養(yǎng)，光鏡下可見細胞呈梭形或多邊形，并有自主搏動。作為實驗陽性對照。
　　3.利用熒光顯

4、微鏡下估算和流式細胞技術直接檢測兩種方法明確三種腺病毒分別轉染C3H10T1/2細胞后的轉染效率，實時熒光定量PCR測定BMP9組細胞（重組腺病毒BMP9轉染后的C3H10T1/2細胞）的BMP9表達量為GFP組和空白組的120-125倍，BMP13組細胞（重組腺病毒BMP13轉染后的C3H10T1/2細胞）的BMP13表達量為GFP組和空白對照組的125-130倍。(p＜0.05)
　　結論:利用HEK293反復擴增得到的高滴度

5、重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP，分別轉染C3H10T1/2細胞后能夠使其獲得較高的轉染效率，并分別高表達BMP9、BMP13以及GFP。
　　第二部分 BMP9及BMP13在體外對C3H10T1/2細胞心肌樣分化的影響及其差異
　　目的:研究并比較BMP9(骨形成蛋白9，Bone morphogeneticprotein，9，)及BMP13（骨形成蛋白13，Bone morphogenetic protein13）在

6、體外對C3H10T1/2細胞向心肌樣細胞分化的影響。
　　方法:實驗分組如下:空白組（未處理的C3H10T1/2細胞），GFP組的（AdEasy-GFP轉染的C3H10T1/2細胞），BMP9組(AdEasy-BMP9轉染的C3H10T1/2細胞)，BMP13組（AdEasy-BMP13轉染的C3H10T1/2細胞），心肌細胞組（新生C3H小鼠的原代心肌細胞）。實驗檢測選取1周，2周，3周，4周四個時間點。利用實時熒光定量PCR檢

7、測各組細胞心肌特異性基因MEF2C，GATA4及離子通道相關編碼基因KCNA5，KCNJ12，CACNA1H，SCN5A的表達情況及差異;利用免疫熒光(Western-blot)和免疫印跡(Immunofluorescence)技術測定各組細胞肌鈣蛋白T(cTnT)、縫隙連接蛋白(Cx43)的是否有表達及其表達的差異;利用透射電鏡和馬松三色染色觀察各組細胞是否存在類似心肌特異性超微結構的表達;利用全細胞膜片鉗技術檢測各組細胞膜上是否存在

8、分別由鈣通道介導的鈣電流，、鈉通道介導的鈉電流及鉀通道介導的內(nèi)、外向鉀電流表達，同時利用實時熒光定量PCR測定介導各種電流的離子通道編碼基因的表達差異。
　　結果:
　　1.通過隨機分組后培養(yǎng)的各組細胞于倒置相差顯微鏡下觀察，與空白對照組相比，經(jīng)過BMP9，BMP13誘導的C3H10T1/2細胞更多呈長梭形，連接更為緊密，排列更為有序一致。
　　2.利用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative

9、pcr)檢測各組細胞心肌特異性基因MEF2C及GATA4的表達差異。實驗結果表明于誘導分化后1周開始，就可以檢測到BMP9組和BMP13組心肌特異性基因MEF2C，GATA4的表達，分別為GFP組和空白組的3倍和2.5-3.5倍(p＜0.05)。 BMP9組和BMP13組離子通道相關編碼基因KCNA5，KCNJ12，CACNA1H的表達，分別為GFP組和空白對照組的3-3.5倍，1.5-4倍和2-6倍(p＜0.05); BMP9組中的S

10、CN5A為BMP913組，GFP組和空白組的4.5倍。(p＜0.05)
　　3.免疫熒光和免疫印跡技術測定各組細胞肌鈣蛋白T(cTnT)、縫隙連接蛋白(Cx43)的表達及其差異。經(jīng)免疫印跡技術檢測各組細胞中，GFP組和空白對照組無cTnT、Cx43表達，BMP9組，BMP13組和心肌細胞組的cTnT和Cx43表達量明顯高于GFP組和空白組，且BMP9組表達高于BMP13組(p＜0.05)。同樣免疫熒光技術能夠在檢測BMP9組，BM

11、P13組和心肌細胞組檢測到cTnT和Cx43表達，GFP組和空白組無表達。
　　4.透射電鏡觀察心肌特異性超微結構肌絲和閏盤的表達情況，和馬松三色染色觀察心肌特異性超微結構肌絲。利用透射電鏡可以到觀察與心肌細胞組一樣，BMP9組及BMP13組有肌絲及閏盤樣的結構，而GFP組和空白組無類似結構;馬松三色染色可以觀察到BMP9組，BMP13組有紅染的肌絲樣結構，而GFP組和空白組無類似結構。
　　5.單細胞膜片鉗檢測各組細胞膜上

12、的鈣通道介導的鈣電流、鈉通道介導的鈉電流及鉀通道介導的內(nèi)、外向鉀電流表達。利用單細胞膜片鉗檢測1、2、3、4周四個時間點各組細胞膜電流的表達情況。在誘導分化后4周，可以在BMP9組，BMP13組檢測到T型鈣電流(IT-Ca)，超速激活延遲整流鉀電流(Ikur)，內(nèi)向整流鉀電流(Ikir);僅在BMP9組少量細胞中可以檢測鈉電流(Ina)。上述電流均可在心肌細胞組中檢測到，而GFP組和空白對照組均未能檢測到上述電流。
　　6.實時熒

13、光定量PCR測定各種電流對應離子通道編碼基因的表達差異。BMP9和BMP13組中，KCNA5的表達量是對照組的3-3.5倍(p＜0.05)，KCNJ12的表達量是對照組的1.5-4倍(p＜0.05)，CACNA1H的表達量是對照組的2-6倍(p＜0.05)，而BMP9組中SCN5A的表達量是對照組和BMP13組的4.5倍(p＜0.05)。
　　結論:BMP9和BMP13可以在體外培養(yǎng)的環(huán)境下促進C3H10T1/2細胞向心肌樣細胞的

14、分化，且BMP9的促分化作用優(yōu)于BMP13。
　　第三部分 BMP9及BMP13轉染后C3H10T1/2細胞對心梗后大鼠心功能的影響及其差異
　　目的:研究并比較BMP9和BMP13對C3H10T1/2細胞在體內(nèi)(SD大鼠心梗模型)向心肌樣細胞分化及對心梗后SD大鼠的心功能的影響。
　　方法:24只SD大鼠（全部選用雄性大鼠）隨機分為四組:MI組（單純心梗組，myocardial infarction，n=6只），MI

15、+GFP組(MI+pAdEasy-GFP轉染C3H10T1/2細胞注射組，n=6只)，MI+BMP9組（MI+pAdEasy-BMP9轉染C3H10T1/2細胞注射組，n=6只），MI+BMP13組(MI+pAdEasy-BMP13轉染C3H10T1/2細胞注射組，n=6只)。利用心臟彩色多普勒超聲監(jiān)測術前及術后4周LVEDD（左室舒張末期內(nèi)徑），LVESD（左室收縮末期內(nèi)徑），F(xiàn)S（左室短軸縮短率）以評估并比較各組大鼠的心功能;利用熒

16、光顯微鏡觀察各組大鼠心臟冰凍切片，尋找手術時植入的帶有GFP綠色熒光示蹤的各組植入細胞;利用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察細胞植入部位的組織細胞形態(tài)特點;馬松三色染色觀察并比較各組心梗面積;免疫熒光觀察植入部位細胞心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T(cTnT)的表達情況。
　　結果:
　　1.心臟彩色多普勒超聲提示術后4周，各細胞植入組心功能均有改善，MI+BMP9組，MI+BMP13組改善程度高于MI+GFP組，MI組，而MI+BMP

17、9組高于MI+BMP13組(P＜0.05)。
　　2.熒光顯微鏡下觀察各細胞植入組心臟冰凍切片，可見自帶GFP綠色熒光示蹤的植入細胞，多數(shù)沿血管分布。
　　3.HE染色可見MI+BMP9組，MI+BMP13，組植入細胞大量聚集，排列較為整齊。
　　4.馬松三色染色提示三個細胞植入組的心臟切片心梗面積百分比均小于MI組(P＜0.05)。但三個細胞植入組的心梗面積百分比差異無顯著性(P＞0.05)。
　　5.免疫熒光