1、結(jié)核作為全球性的健康問題，其發(fā)病和死亡率逐年上升，結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌，能夠在宿主巨噬細胞中持續(xù)存活，同時作為艾滋病病人的主要機會致病菌，在世界范圍內(nèi)有三分之二，即20億人口被其感染，每年導(dǎo)致8百萬人發(fā)病，2-3百萬人死亡。由于在過去的40年中，沒有理想的抗結(jié)核藥被開發(fā)、艾滋病的流行、更重要的是結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)和廣泛傳播，使結(jié)核病的疫情進一步惡化，成為世界范圍內(nèi)的頭號殺手。 世界衛(wèi)生組織已將結(jié)核病列為重點控制的

2、三種傳染病之一，宣布全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)，強調(diào)遏制結(jié)核病行動已到了刻不容緩的程度。在2004年召開的第二屆“消除結(jié)核病”會議和世界衛(wèi)生組織召開的“世界結(jié)核報告”均指出結(jié)核病的控制仍需一個漫長的過程。由此可見，開發(fā)具有更強抑制結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株活性、降低毒性和縮短療程的抗結(jié)核新藥，徹底攻克結(jié)核病，已是迫在眉睫。 吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)是與結(jié)核分支桿菌細菌細胞壁糖和脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶，與結(jié)核分枝桿菌中密度脂蛋白代謝和

3、呼吸作用相關(guān)，是結(jié)核分枝桿菌生存必需的。TrpC是編碼IGPS的基因，通過Himarl轉(zhuǎn)座子突變法證實trpC是結(jié)核分枝桿菌和牛型分支桿菌的必需基因。 此外，本實驗室通過雙向電泳證實，IGPS在異煙肼耐藥株中的表達顯著高于異煙肼敏感株，抗結(jié)核治療后IGPS表達顯著下調(diào)。IGPS屬于芳香族，而哺乳動物和人類中均不存在芳香族；同時，采用BLASTP分析軟件在NCBI(http：//www,ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中未

4、發(fā)現(xiàn)人類存在與IGPS同源的蛋白質(zhì)和氨基酸序列。 因此，IGPS是一個很好的抗結(jié)核藥物靶位候選對象，尤其是針對異煙肼耐藥菌株。 在本論文中，檢測了體外培養(yǎng)的結(jié)核分支桿菌中IGPS的編碼基因trpC在轉(zhuǎn)錄水平的表達；首次克隆并在大腸桿菌中表達、純化了含6個His-tag的重組結(jié)核分支桿菌IGPS，研究了含His-tag的重組IGPS酶學(xué)性質(zhì)并與切除His-tag的重組IGPS進行比較；建立了體外酶學(xué)檢測體系，篩選到10種可

5、以不同程度抑制結(jié)核分支桿菌IGPS活性的中藥單體，并通過體外抑制恥垢分枝桿菌的作用進行驗證；檢測了不同條件下含His-tag的重組IGPS酶的二級結(jié)構(gòu)變化。 P5CR與結(jié)核分支桿菌中密度脂蛋白代謝及呼吸作用相關(guān)，ProC(Rv0500)即編碼P5CR的基因，證明為結(jié)核分支桿菌毒力相關(guān)基因，而且是結(jié)核分支桿菌生存所必需的。定向破壞proC基因形成的結(jié)核分支桿菌營養(yǎng)缺陷型突變株在體外培養(yǎng)的巨噬細胞內(nèi)的存活能力降低，對免疫缺陷SCID

6、鼠的毒力很弱，對正常鼠完全沒有毒力。作為疫苗，proC突變株表現(xiàn)出與BCG更強的保護力。因此，P5CR是一個很好的抗結(jié)核藥物靶位候選對象。 RT-PCR檢測了體外培養(yǎng)的結(jié)核分支桿菌中P5CR的編碼基因proC在轉(zhuǎn)錄水平的表達；首次克隆并在大腸桿菌中表達、純化了含6個His-tag的重組結(jié)核分支桿菌P5CR，通過質(zhì)譜分析證明其分子量與理論值完全一致。研究了含His-tag的重組P5CR酶學(xué)性質(zhì)并與切除His-tag的重組P5CR進