1、目的:
　　探討生長(zhǎng)阻滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因45gGadd45g對(duì)垂體瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬的影響，為應(yīng)用該基因在垂體瘤臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用原代培養(yǎng)的新生鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，震蕩法純化星形膠質(zhì)，GFAP免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，構(gòu)建Gadd45g sh RNA干擾質(zhì)粒pLKO.1-sh-Gadd45g，并進(jìn)行慢病毒包裝。
　　3.克隆Ga

2、dd45g基因的CDS區(qū)序列至真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG，構(gòu)建Gadd45g真核表達(dá)載體p3XFLAG-Gadd45g。
　　4.qPCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞和垂體瘤AtT-20細(xì)胞兩細(xì)胞中的Gadd45g mRNA表達(dá)水平。
　　5.本研究以干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞Gadd45g為對(duì)照組，以恢復(fù)垂體瘤AtT-20細(xì)胞Gadd45g表達(dá)為實(shí)驗(yàn)組;慢病毒pLKO.1-sh-Gadd45g感染原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，qPCR檢測(cè)Gadd45

3、g mRNA干擾效率;p3XFLAG-Gadd45g轉(zhuǎn)染垂體瘤AtT-20細(xì)胞，qPCR檢測(cè)Gadd45g mRNA表達(dá)效率及Western Blot檢測(cè)融合蛋白FLAG-Gadd45g表達(dá)水平;CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色后細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;MDC熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬活性;免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)情況;WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3及自噬相關(guān)蛋白Bec

4、lin、LC3表達(dá)情況;
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)PCR鑒定和上海生工測(cè)序表明，Gadd45g真核表達(dá)載體及其特異性shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功;
　　2.Western blot、qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的p3XFLAG-Gadd45g載體能夠在垂體瘤AtT-20細(xì)胞中表達(dá);qPCR檢測(cè)結(jié)果表明Gadd45g sh RNA慢病毒載體pLKO.1-sh-Gadd45g在星形膠質(zhì)細(xì)胞中具有沉默效率（干擾效率約52％，P＜

5、0.05）。
　　3.qPCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞和垂體瘤AtT-20細(xì)胞兩細(xì)胞中的Gadd45g mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，垂體瘤AtT-20細(xì)胞表達(dá)水平較低，而對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Gadd45g mRNA表達(dá)水平相對(duì)較高(P＜0.05)。
　　4.恢復(fù)垂體瘤AtT-20細(xì)胞Gadd45g表達(dá)，CCK-8結(jié)果表明可抑制細(xì)胞增殖(抑制率約為70.8％，P＜0.05); Western Blot結(jié)果表明可明顯增加Caspas

6、e-3表達(dá)水平(P＜0.01);細(xì)胞流式技術(shù)結(jié)果表明可促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡(P＜0.01); Western Blot結(jié)果同樣表明了Beclin1表達(dá)水平(P＜0.05)及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P＜0.05); MDC熒光染色、免疫熒光結(jié)果表明可抑制細(xì)胞自噬活性。
　　5.在對(duì)照組中，靶向沉默星形膠質(zhì)細(xì)胞Gadd45g表達(dá)，CCK-8結(jié)果表明可促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞增殖(增值率約為131.06％，P＜0.05)，Western Blot結(jié)果表

7、明可明顯抑制Caspase-3表達(dá)水平(P＜0.01);細(xì)胞流式技術(shù)結(jié)果表明可抑制細(xì)胞早期凋亡(P＜0.05); Western Blot結(jié)果同樣表明了Beclin1表達(dá)水平(P＜0.01)及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高(P＜0.05); MDC熒光染色、免疫熒光結(jié)果表明可增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性。
　　結(jié)論:
　　垂體瘤中Gadd45g的表達(dá)缺失可能使得垂體瘤AtT-20細(xì)胞凋亡受阻及自噬作用增強(qiáng)，從而促進(jìn)垂體瘤的發(fā)生發(fā)展?；謴?fù)垂體瘤細(xì)