1、目的：①在反復氣喘病人和哮喘動物中研究Cbl-b和ORMDL3的表達以及兩者之間的關系，進一步在細胞中改變Cbl-b的表達，探討Cbl-b對ORMDL3表達的影響及可能機制；②探討肥大細胞中過表達或敲低Cbl-b后TLR4/NF-κB信號通路的變化，分析其可能的分子機制。
　　方法：用卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘小鼠模型，利用定量RT-PCR技術檢測哮喘小鼠肺組織中ORMDL3基因的表達。收集正常和反復

2、氣喘兒童外周血，定量RT-PCR檢測ORMDL3基因和Cbl-b基因的表達。構建Cbl-b的過表達質粒，將包含ORMDL3基因啟動子序列的質粒和Cbl-b的過表達質?；駽bl-b的小干擾序列共轉染細胞，再給予IL-4刺激細胞，通過螢光素酶報告基因檢測技術研究改變Cbl-b表達后ORMDL3啟動子活性的變化。在Hela、293-T細胞中轉染Cbl-b過表達質粒或Cbl-b的小干擾序列，定量RT-PCR檢測IL-4刺激后細胞ORMDL3 m

3、RNA的表達水平。利用染色質免疫沉淀(chromatinimmunoprecitation，CHIP)技術鑒定STAT6與ORMDL3啟動子區(qū)的結合。在293-T細胞中過表達或干擾Cbl-b后，給予IL-4激發(fā)細胞，Westemblot檢測磷酸化STAT6和總STAT6蛋白的變化。在肥大細胞中過表達及敲低Cbl-b，給予LPS刺激細胞后，利用定量RT-PCR技術檢測細胞中IL-6和TNF-α mRNA表達量的變化，同時利用ELISA檢測

4、細胞上清IL-6和TNF-α蛋白的表達。為探索Cbl-b是否通過間接影響NF-κB而調控IL-6和TNF-α的表達，我們將含有NF-κB-UJC報告基因質粒（多克隆位點插入了NF-κB結合位點的螢光素酶報告基因質粒)和Cbl-b過表達質?；駽bl-b的小干擾序列共轉染肥大細胞，再與LPS(1 ug/ml)共培養(yǎng)24小時，收集裂解物測螢光素酶的活性。通過免疫印跡的方法檢測Cbl-b過表達或小干擾后肥大細胞內磷酸化IκB和JNK以及它們總蛋

5、白水平的變化。
　　結果：動物實驗發(fā)現(xiàn)OVA組小鼠肺組織ORMDL3表達較生理鹽水對照組明顯升高。定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)反復氣喘兒童外周血Cbl-b的表達較正常兒童低(mean±s.d.0.0562±0.03294 vs0.1029±0.06454，p＜0.05)，而ORMDL3在反復氣喘兒童中的表達量高于正常兒童(mean±s.d.0.0367±0.01061 vs0.0148±0.01063;p＜0.001)，Cbl-b與O

6、RMDL3之間存在負相關(r=-0.8127，p＜0.01）。將構建成功的Cbl-b過表達質?；蚱湫「蓴_序列轉染細胞，48小時后利用Western Blot檢測Cbl-b蛋白的變化，證實Cbl-b過表達或干擾表達成功。在A549、293T細胞中敲低或過表達Cbl-b后發(fā)現(xiàn)，過表達Cbl-b可抑制IL-4誘導的ORMDL3基因啟動子活性，而敲低Cbl-b上調了ORMDL3的啟動子活性，而且敲低Cbl-b后ORMDL3 mRNA表達量顯著上

7、升，過表達Cbl-b則引起ORMDL3mRNA顯著下降。（*p＜0.05，**p＜0.01），這表明Cbl-b能在轉錄水平上調控ORMDL3。之后我們在細胞中過表達Cbl-b發(fā)現(xiàn)STAT6的磷酸化水平顯著下降，而敲低Cbl-b基因后STAT6的磷酸化蛋白顯著升高。進一步的染色質免疫沉淀實驗(CHIP)證實與STAT6結合的基因組DNA中包含ORMDL3啟動子區(qū)的STAT6結合區(qū)域，表明在293T細胞中，轉錄因子STAT6能與ORMDL3

8、的啟動子結合。肥大細胞中過表達和小干擾Cbl-b后檢測Cbl-b的蛋白表達，證明過表達質粒構建和細胞轉染以及小干擾沉默Cbl-b成功。用siRNA-cblb或Cbl-b過表達質粒(pEGFP-cblb)轉染肥大細胞，同時與LPS共培養(yǎng)24小時后，RT-PCR結果顯示Cbl-b過表達組的IL-6和TNF-α mRNA明顯低于正常對照組（*P＜0.05，**P＜0.01），而表達沉默組則較空白組增高(**P＜0.01)。為進一步明確Cbl-

9、b是否對肥大細胞中IL-6和TNF-α蛋白表達存在影響，我們過表達或敲低肥大細胞Cbl-b表達，再與LPS共培養(yǎng)24小時。細胞上清ELISA結果顯示，Cbl-b過表達組細胞上清中的IL-6和TNF-α蛋白濃度明顯低于正常對照組(**P＜0.01)，而表達沉默組則較空白組增高(*P＜0.05)。為探索Cbl-b是否通過間接影響NF-κB而調控IL-6和TNF-α的表達，我們在肥大細胞中共轉染含有NF-κB-UJC報告基因質粒和pEGFP-

10、cblb質粒或Cbl-b的小干擾序列，與LPS共培養(yǎng)24小時，結果發(fā)現(xiàn)Cbl-b過表達組螢光素酶活性與比對照組相比降低，Cbl-b敲低組與對照組比較升高。說明Cbl-b顯著降低了LPS刺激后肥大細胞內NF-κB-UJC螢光素酶活性（*P＜0.05）。免疫印跡法檢測磷酸化IκB和.JNK水平，發(fā)現(xiàn)磷酸化的IκB和JNK在siRNA-cblb組表達增高，而在pEGFP-cblb組中則顯著下降。
　　結論：ORMDL3在哮喘小鼠肺組織中