1、目的：在前期研究基礎(chǔ)上進一步以CCL4肝纖維化大鼠為實驗研究對象，運用ELISA、熒光定量PCR和免疫組化等方法研究三葉香茶菜對TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路的影響，以明確三葉香茶菜是否通過調(diào)控TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路進而達到抗肝纖維化的作用。本項目通過研究三葉香茶菜對TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路的影響，有望從信號傳導(dǎo)分子水平上明確三葉香茶菜抗肝纖維化機制，為三葉香茶菜抗肝纖維化提供新的基礎(chǔ)理論。
　　方法：

2、　　1.三葉香茶菜浸膏的提取、濃縮、抽濾，主要采用水提醇沉法提取，經(jīng)濃縮過濾，收集濾液再濃縮成浸膏；
　　2.實驗動物分組及造模：清潔級SD大鼠106只，雌雄各半，體重140～180克。隨機分為6組，空白對照組、秋水仙堿組、模型對照組組、三葉香茶菜高劑量組、三葉香茶菜中劑量組以及三葉香茶菜低劑量組。三葉香茶菜高劑量組（80g/kg，按生藥量計）、三葉香茶菜中劑量組（40g/kg，按生藥量計）、三葉香茶菜低劑量組（20g/kg，按生

3、藥量計），治療12周?？瞻捉M對照組給予飲食飲水自由處理。模型組、陽性組和三葉香茶菜給藥組，每3天給予皮下注射40％CCL4花生油混合溶液，按照3ml/Kg，而陽性組每天給與秋水仙堿灌胃，三葉香茶菜給藥組每天給予HIT灌胃，空白組和模型組每天給予純凈水灌胃，實驗時間共12周，成模檢驗后，取血剖肝；
　　3.運用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清AST、ALT、IL-1β、IL-6、TNF-α的血清表達。
　　4.運用熒光定量

4、PCR法檢測肝組織內(nèi)的TLR4、MyD88的mRMA表達；5.運用免疫組化法檢測肝組織NF-κB的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.模型組大鼠12周末體重、肝臟臟器系數(shù)均明顯高于空白組(P<0.01)，有顯著性差異。秋水仙堿組體質(zhì)重與模型對照組比較有明顯差異(P<0.05)，肝臟系數(shù)明顯優(yōu)于模型組(P<0.01)，有顯著性差異，HIT高劑量組、中劑量組肝臟系數(shù)優(yōu)于模型組(P<0.05)，有差異性；HIT低劑量組與模型組相比無統(tǒng)

5、計意義。
　　2.模型組大鼠血清ALT活力水平與空白組相比，具有明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)；模型組大鼠血清AST與空白組相比，具有明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，秋水仙堿組、HIT高劑量組、HIT中劑量以及HIT低劑量組可顯著降低肝纖維化大鼠血清ALT活性水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。與模型組相比，秋水仙堿組(P<0.01)、HIT高劑量和HIT中劑量組(P<0.0

6、5)可降低肝纖維化大鼠血清 AST表達水平， HIT低劑量組和模型組比無顯著性差異(P>0.05)；
　　3.模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達均異常升高，分別與空白組相比，均有顯著性差異(P<0.01)。與模型組相比，秋水仙堿組、HIT高劑量組可顯著降低肝纖維化大鼠血清IL-1β表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），HIT中劑量和HIT低劑量組IL-1β表達水平有下降趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)

7、計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，秋水仙堿組、HIT高劑量可降低肝纖維化大鼠血清IL-6表達水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HIT中劑量組也可顯著降低肝纖維化大鼠血清IL-6表達水平，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；HIT低劑量組可降低肝纖維化大鼠IL-6表達，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，秋水仙堿組可顯著降低肝纖維化大鼠血清TNF-α表達水平(P<0.01)，HIT中劑量

8、組（P<0.05）可降低肝纖維化大鼠血清TNF-α表達水平（P<0.05），HIT高劑量組、低劑量組降低TNF-α的表達，但與模型組相比較，差異統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.與空白組相比較，模型組大鼠肝臟組織TLR4mRNA的表達，差異具有顯著性（P<0.01)；三葉香茶菜高劑量組、秋水仙堿組TLR4mRNA的表達與模型組相比有顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；三葉香茶菜中、低劑量組TLR4mRN

9、A的表達與模型對照組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與空白組相比較，模型組大鼠肝臟組織MyD88mRNA表達有明顯升高，差異有顯著性(P<0.01)。三葉香茶菜低劑量治療組相比模型組，MyD88mRNA的表達水平無顯著性差異(P>0.05)，秋水仙堿組MyD88 mRNA表達與模型組相比有顯著差異(P<0.05)。
　　5.模型組與空白對照組比較，NF-кBp65陽性細胞表達顯著增多(P<0.01)，肝細胞、肝竇周圍、匯管區(qū)血管壁和膽管

10、壁周圍的間質(zhì)細胞可見陽性深著色區(qū)，偶可見片狀融合區(qū)，著色強烈。與模型組比較，秋水仙堿組NF-k Bp65蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)；三葉香茶菜高劑量組、中劑量組和低劑量組 NF-κBp65蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，著色區(qū)部分成小片狀，可見少量淡黃色著色細胞。
　　結(jié)論：
　　1.三葉香茶菜能降低肝纖維化大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-a促炎細胞因子的表達，抑制大鼠的肝肝組織的炎癥反炎，抑制肝細胞的

11、炎癥損傷，進一步抑制了IL-1β、IL-6、TNF-a等對HSC等細胞的激活，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。
　　2.三葉香茶菜能明顯抑制的肝纖維化大鼠的TLR4mRMA和NF-κBp65蛋白表達，對MyD88的表達無影響。以上實驗結(jié)果可推斷三葉香茶菜抗肝纖維的機制之一是通過調(diào)控動物機體的非MyD88依賴性的TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路，進而抑制IL-1β、IL-6、TNF-a等炎性細胞因子的表達，抑制肝細胞的炎癥損傷，進一步抑制了