1、目前,腫瘤多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)已成為腫瘤治療中面臨的一大難題,所謂腫瘤MDR是指腫瘤接觸了某些抗癌藥物后產生對其他多種未接觸過的、結構無關和作用機制完全不同的抗癌藥物也具有交叉耐藥性。腫瘤MDR產生的機制十分復雜,主要包括:細胞凋亡敏感性降低、細胞存活信號通路的異?；罨?、藥物外排泵ABC轉運蛋白(P-glycoprotein,P-gp等)過表達、藥物作用靶點的改變、DNA損傷修復活性增強、藥物解

2、毒與消除酶活性增強或過表達等。
　　 腫瘤MDR逆轉劑是通過抑制轉運蛋白的功能或表達,恢復耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。與此不同,抗耐藥藥物則是通過直接殺傷或抑制耐藥腫瘤克服腫瘤MDR。近年來,抗耐藥研究越來越受到人們的重視。我國天然產物資源豐富,從天然產物及其衍生物中尋找新型抗耐藥化合物或腫瘤MDR逆轉劑具有廣闊的前景。在此,我們發(fā)現(xiàn)漢防己甲素新型衍生物H1在體內、外均顯示出良好的抗耐藥作用,而且在無毒濃度時能顯著逆轉P-g

3、p所介導的腫瘤MDR,并對其分子機制進行了初步探討。
　　 本論文主要分為兩部分:第一部分,H1抗耐藥藥效學評價及其分子機制研究；第二部分,無毒濃度H1逆轉P-gp介導的腫瘤MDR作用及對P-gp表達與功能的影響。
　　 第一部分H1抗耐藥藥效學評價及其分子機制研究
　　 本部分實驗主要研究了漢防己甲素新型衍生物H1體內、外抗耐藥作用及其對敏感株、耐藥株細胞凋亡通路與存活信號通路的影響。采用MTT比色法測定H1對

4、8株不同組織來源腫瘤細胞的細胞毒活性,再以KB、KBv200；MCF-7、MCF-7/adr；A549、A549/tax親本與其相應的耐藥細胞為研究對象,以三種常用的抗腫瘤藥物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、長春新堿(VCR)為對照,系統(tǒng)評價了H1體外抗耐藥作用。建立敏感性KB、耐藥性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR為陽性對照藥,結合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的體內耐藥性,進而采用KB、KBv200裸鼠移植

5、瘤模型評價H1低、中、高(10、15、20mg/kg)三個劑量的抗腫瘤效果,評價H1體內抗耐藥作用。PI單染法流式細胞儀檢測H1對敏感株細胞KB、耐藥株細胞KBv200細胞周期的影響。采用DAPI染色法觀察細胞形態(tài)學變化；瓊脂糖凝膠電泳分析細胞DNA片段化狀態(tài)；PI-AnnexinV雙染法定量檢測H1誘導KB、KBv200細胞凋亡作用。JC-1染色法檢測H1對KB、KBv200細胞線粒體膜電位的影響。H1處理KB、KBv200細胞24h

6、后,Western blot方法檢測內源性凋亡通路相關蛋白:Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表達及線粒體膜間隙蛋白細胞色素-C、AIF的釋放；外源性凋亡通路相關蛋白:Fas、FasL、Caspase-8的表達；以及細胞存活性信號通路P13K-AKT、MEK-ERK中關鍵分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表達。與此同時,以Bel7042/5-Fu細胞為研究對象,以5-Fu為對照,評價了

7、:Bel7042/5-Fu細胞的耐藥特性及H1對Bel7402/5-Fu與Bel7402細胞的生長抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu細胞及H1(4μM)處理細胞24h后的mRNA,以瓊脂糖凝膠電泳進行RNA質量檢測。采用Affimatrix基因表達芯片平臺分析敏感株細胞Bel7402,耐藥株細胞Bel7402/5-Fu,以及H1處理后Bel7402、Bel7402/5-Fu細胞全基因組表達水平變化

8、。
　　 研究結果顯示:H1對8株不同組織來源的腫瘤細胞都具有不同程度的生長抑制作用,IC50在1-4μM之間,對KB、Bel7402的生長抑制作用較為顯著,IC50分別為1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。體外抗耐藥作用研究顯示H1不僅對敏感株細胞具有較好的殺傷作用,而且對耐藥株細胞也同樣具有顯著的抑制作用,平均耐藥因子(resistant factor,RF)僅為1.6,而三種抗腫瘤藥物TAX、ADR、V

9、CR的平均耐藥因子分別為:22.6、71.7、52.3?？梢?在體外H1具有良好的抗耐藥作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤實驗表明:在敏感性KB裸鼠模型,VCR給藥組的相對腫瘤體積抑制百分率、瘤重抑制百分率分別為:84.4％、82.1％,顯示出良好的抗腫瘤效果。但在耐藥腫瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR給藥組的相對腫瘤體積抑制百分率、瘤重抑制百分率則分別為:12.6、27.7％,KBv200細胞在體內仍然對VCR展現(xiàn)良好的耐藥

10、作用,證明建立的體內耐藥移植瘤模型是成功的。H1無論在敏感性KB裸鼠移植瘤還是在耐藥性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有顯著的抗腫瘤效果,并且顯示良好的劑量依賴關系。尤其是H1高劑量組(即20mg/kg)對敏感株KB裸鼠移植瘤的相對腫瘤體積與重量抑制百分率分別為79.7％、79.0％:對耐藥株KBv200裸鼠移植瘤的相對腫瘤體積與重量抑制百分率分別為61.5％、74.9％?？梢?H1在我們建立的體內移植瘤耐藥模型中仍具有良好的抗耐藥作用。

11、作用機制顯示:H1對KB、KBv200細胞周期分布無顯著影響,但我們觀察到隨著H1濃度的增加出現(xiàn)凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色顯示細胞核皺縮、碎裂、染色加深,且凋亡細胞的百分率隨著H1濃度的升高而增加。瓊脂糖凝膠電泳檢測到典型的:DNA片段化(DNALadder)現(xiàn)象。PI-AnnexinV染色后發(fā)現(xiàn)H1誘導KB細胞的凋亡作用略強于耐藥株細胞KBv200,8μMH1處理組誘導KB細胞晚期凋亡百分率為85.4％,而誘導耐藥細胞KBv

12、200細胞晚期凋亡的百分率為42.4％,這一結果與細胞增殖抑制活性結果相一致。無論在敏感細胞KB還是在耐藥細胞KBv200,H1均能升高Bax/Bcl-2比例、降低線粒體膜電位、使細胞色素-C、AIF從線粒體釋放到胞漿,進而活化Caspase-3,啟動內源性凋亡通路；但H1對Fas、FasL、Caspase-8的表達無影響,提示H1誘導KB、KBv200細胞凋亡不依賴于外源性凋亡通路。KB細胞對H1的凋亡敏感性略強于耐藥細胞KBv200

13、。同時,H1能顯著抑制ERK、AKT的磷酸化水平,下調P13K-AKT、MEK-ERK信號通路,這可能與H1的抗耐藥作用相關。
　　 另一方面,Bel7402/5-Fu細胞對5-Fu具有明顯的耐藥性,耐藥因子為161.1,而H1的耐藥因子僅為6.0,H1在Bel7402/5-Fu細胞顯示出一定的抗耐藥作用?；虮磉_芯片結果顯示Bel7402/5-Fu細胞與親本細胞Bel7402相比,發(fā)生主要變化的基因為有非受體酪氨酸激酶FYN(

14、上調),p38MAPK(上調),凋亡效應激酶Caspase-3基因(下調)。JAK-STAT通路相關基因表達上調,AKT基因上調,抗凋亡作用增強。H1處理后Bel7402/5-Fu細胞與親本細胞Bel7402相比,發(fā)生主要變化的有Fas/FasL介導的外源性凋亡相關基因(下調)。非受體酪氨酸激酶FYN(上調),P13K-AKT通路相關基因(上調)。
　　 上述結果表明:無論在體外還是體內,H1均顯示出良好的抗耐藥作用。其分子機制

15、可能與啟動內源性凋亡通路、下調細胞存活通路P13k-AKT、MEK-ERK等有關。
　　 第二部分無毒濃度H1逆轉P-gp介導的腫瘤MDR作用及對P-gp表達與功能的影響
　　 本部分實驗主要研究了無毒濃度H1對P-gp介導腫瘤MDR的逆轉作用并檢測其對P-gp表達與功能的影響。采用MTT比色法測定H1對KB、MCF-7與其相應的P-gp過表達耐藥株KBv200、MCF-7/adr細胞的生長曲線,以維拉帕米(VRP)為陽

16、性對照藥,選擇無毒濃度H1(0.125、0.25、0.5μM)與3種抗腫瘤藥物VCR、ADR、TAX合用評價其逆轉腫瘤MDR作用,并計算逆轉倍數(shù)(reversal fold,RF)。流式細胞儀測定H1處理后KBv200細胞P-gp對其底物阿霉素、羅丹明123的蓄積與外排功能的影響。Pgp-GloTM試劑盒檢測H1對VRP刺激的重組P-gpATPase活性的影響。計算機輔助設計Discovery.Studio分子模擬軟件對H1的空間結構與

17、P-gp三維構象進行了分子對接模擬,考察H1分子與P-gp結合能力。Western blot方法檢測無毒濃度H1處理KBv200細胞48h后P-gp表達水平,RT-PCR檢測MDRI轉錄水平的變化。引入放線菌酮(CHX)考察0.5μM H1處理后對P-gp半衰期的影響。免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)檢測H1對P-gp泛素化水平的影響。同時考察H1對KBv200細胞MAPK信號通路的影響以及RNAi沉默ERK1