1、目的：血管平滑肌細胞（VSMC）的增殖和分化受由一系列調節(jié)因子構成的復雜網絡所調控。在這個網絡中，促增殖因子，如Krüppel樣因子5（KLF5）與促分化因子，如維甲酸受體（RAR）在功能上相互影響、相互制約，共同參與細胞生長、增殖、分化及凋亡等過程的調節(jié)。已經證明，KLF5通過調節(jié)細胞周期調節(jié)因子的表達而促進多種細胞增殖。在心血管系統(tǒng)，KLF5通過促進細胞增殖而在心血管重塑過程中扮演重要的角色。RAR是一類重要的核受體，與其特異性配體

2、結合后，通過激活或抑制一系列基因的表達而誘導細胞分化。目前已分離到三種RAR亞型：RARα，RARβ和RARγ。大量研究表明，VSMC中存在與維甲酸結合的RARα，通過該受體，維甲酸及其衍生物能促進VSMC分化，抑制其過度增殖。本實驗研究Am80與RARα相互作用所激活的信號通路及其抑制KLF5與RARα相互作用的分子機制。
　　 方法：用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠VSMC，胰蛋白酶消化傳代，取3～5代細胞進行實驗。通過免疫共沉淀研究

3、KLF5與RARα相互作用，Western blot分析檢測Am80對KLF5和RARα表達及不同信號通路抑制劑對信號通路活化、KLF5磷酸化以及KLF5與RARα相互作用的影響。
　　 結果：⑴2μM Am80刺激VSMC不同時間和不同濃度Am80刺激細胞24 h，RARα的表達水平呈時間和劑量依賴性升高；而KLF5的表達水平則呈時間和劑量依賴性降低。提示，Am80能誘導RARα表達，抑制KLF5表達；⑵提取被Am80刺激不同

4、時間（0、0.5、1、2 h）的VSMC總蛋白，進行交互免疫共沉淀。結果顯示，在Am80刺激前后的VSMC中，KLF5和RARα均可被共沉淀，提示KLF5與RARα之間存在相互作用。Am80刺激后，免疫沉淀物中的KLF5和RARα均明顯減少，說明Am80抑制二者之間的相互作用。與對照組相比，二者之間的結合在Am80刺激0.5h和1 h明顯降低，2 h基本恢復至刺激前水平。與正常組和模型組相比，給藥3天組的動物模型血管組織中，KLF5與R

5、ARα的相互作用顯著減少。14天后二者之間的交互作用有所增強，但仍明顯低于正常組及模型組；⑶Am80作用于VSMC0.5 h，KLF5的磷酸化水平迅速降低，2 h回升。表明Am80能誘導KLF5快速脫磷酸化。且KLF5的磷酸化水平變化與它和RARα的結合活性變化相一致。提示Am80通過誘導KLF5脫磷酸化抑制其與RARα的相互作用。Am80刺激VSMC0.5 h，Akt的磷酸化水平明顯升高，并持續(xù)至刺激后2 h。與之相反，p38磷酸化水

6、平于Am80刺激后0.5 h明顯降低，并持續(xù)至刺激后2 h。上述結果提示，在VSMC中，Am80能激活PI3K/Akt信號通路，抑制p38MAPK信號通路，這兩條通路在Am80誘導KLF5脫磷酸及抑制KLF5與RARα相互作用過程中發(fā)揮重要的作用；⑷為進一步證明Am80誘導KLF5脫磷酸化與Akt信號通路激活有關，用Akt抑制劑LY294002預處理VSMC2 h，再用Am80刺激細胞1 h后，檢測KLF5磷酸化水平。結果顯示，LY29

7、4002能明顯抑制Am80誘導的KLF5脫磷酸化。同時，交互免疫共沉淀結果表明，LY294002能逆轉Am80對KLF5與RARα相互結合的抑制作用。上述結果進一步表明，Am80通過PI3K/Akt信號通路誘導KLF5脫磷酸化，進而抑制其與RARα的相互作用；⑸為探討p38 MAPK信號通路在KLF5磷酸化修飾中的作用，應用p38持續(xù)活化型質粒pSV-mkk6b轉染VSMC，收集細胞檢測KLF5磷酸化水平。結果表明，持續(xù)激活p38 MA

8、PK信號通路能明顯抑制Am80誘導的KLF5脫磷酸化。用p38抑制劑SB203580（20μM）預孵育細胞2 h后，給予Am80刺激1 h，收集細胞進行免疫共沉淀分析。結果表明，SB203580能進一步增強Am80對KLF5與RARα相互作用的抑制作用。表明，Am80通過p38MAPK信號通路抑制KLF5磷酸化，進而抑制其與RARα的相互作用；⑹Akt抑制劑LY294002能逆轉Am80對p38磷酸化的抑制作用，而p38抑制劑SB203

9、580對Akt的磷酸化修飾無明顯影響。提示，在Am80刺激的VSMC中，PI3K/Akt與p38 MAPK信號通路之間存在信號交談，前者位于后者上游。
　　 結論：①Am80誘導RARα表達，抑制KLF5表達；②Am80抑制KLF5與RARα相互作用；③Am80通過PI3K/Akt通路誘導KLF5脫磷酸化，進而抑制KLF5與RARα相互作用；④PI3K/Akt與p38 MAPK信號通路之間存在信號交談，前者系后者的上游信號分子。