1、棒狀體（rhoptry）是存在于頂復門原蟲的一種特殊亞細胞器，與微線（microneme）、類錐體（conoid）等一起共同形成其分類上的結(jié)構(gòu)特點-頂端復合體（Apical complex）。對瘧原蟲、弓形蟲等的深入研究表明，在頂復門原蟲入侵過程中，通過蟲體前端與宿主細胞膜之間形成一個活動的連接區(qū)域--運動結(jié)合體（Moving Juction，MJ），并介導蟲體入侵過程的早期機制，已知微線分泌的頂膜抗原（Apical Membrane

2、Antigen1，AMAl）及部分棒狀體頸部蛋白（RON2、RON4、RON5）是形成MJ復合物的重要成分或功能分子。然而迄今對艾美耳球蟲棒狀體蛋白和棒狀體頸部蛋白尚未進行任何研究。
　　 本研究利用生物信息學和比較基因組學技術(shù)注釋拼接得到柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）棒狀體頸部蛋白2（EtRON2）的基因序列，以預測的序列設(shè)計特異性引物，以.E.tenella子孢子總RNA為模板，用RT-PCR的方法擴增出E

3、tron2全長ORF；并以此全長ORF序列設(shè)計特異性引物，以E.tenella子孢子的基因組DNA為模板，用PCR方法成功擴增出Etron2ORF片段的gDNA序列片段。生物信息學分析結(jié)果顯示，Etron2ORF片段的gDNA含有11個內(nèi)含子；ORF全長為4020bp，編碼一包括5’端信號肽的全長為1339個氨基酸的多肽片段，與其他物種RON2的氨基酸序列相似性為15％-41％。
　　 通過生物信息學方法解析EtRON2的抗原性

4、及其疏水性，以此對Gene Bank和E.tenella基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索比對，選擇EtRON2特異性的潛在抗原表位。以其序列設(shè)計引物，特異性擴增編碼抗原表位的序列片段（EtRON2Ag，序列長度為228bp，編碼925-1152位點的76個氨基酸），構(gòu)建pMAL-c2x-EtRON2Ag重組子，于E.coli Rosseta（DE3）中重組表達并免疫小鼠制備特異性抗體，利用激光共聚焦顯微鏡研究EtRON2在E.tenella子孢子內(nèi)

5、的免疫熒光亞細胞定位；分別收集感染E.tenella后5、7、10、15、20日雞的血清，以EtRON2Ag抗原包被ELISA板，檢測收集血清中Anti-EtRON2Ag的效價。結(jié)果顯示，EtRON2定位于E.tenella子孢子的頂端；ELISA法檢測感染E.tenell10天后雞血清中EtRON2Ag的抗體效價為1:50，初步表明E.tenella在感染雞體過程中可以分泌表達EtRON2蛋白，并誘導產(chǎn)生抗體。
　　 選取E.

6、tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；選擇Etact加作為參照基因，Etron2和Etama為目的基因，設(shè)計實時熒光定量PCR的引物，分析E.tenella生活史中不同發(fā)育階段Etam2和Etama轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示，Etron2在未孢子化卵囊中轉(zhuǎn)錄水平最高，然后分別是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子，說明可能在未孢子化階段基因被儲備，以便于入侵時大量分泌；Etama

7、在子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高，其他階段都相對很低，說明子孢子階段該基因的表達蛋白分泌最旺盛；比較Erton2和Etama轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，子孢子階段Etama轉(zhuǎn)錄水平更高，提示EtAMA蛋白在子孢子入侵宿主細胞時具有更重要或更長時間的作用。
　　 選擇不同的原核表達載體（pET-32a（+）、pMAL-c2x、pCold-TF和pCold-SUWO），利用不同表達菌（E.coli Rosseta（DE3）、E.coli BL21）重組表