1、色譜法（層析法）,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解色譜法分離、提純有機(jī)化合物的基本原理和應(yīng)用。2、掌握柱層析、薄層層析的操作技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,色譜法（Chromatography）亦稱(chēng)色層法、層析法等。 色譜法是分離、純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一。色譜法的基本原理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其親和性的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用，從而使各組分分離。,色譜法須在兩相系

2、統(tǒng)間進(jìn)行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動(dòng)相，是液體或氣體。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，被分離物質(zhì)在兩相間的分配，由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復(fù)平衡，即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過(guò)程。隨著流動(dòng)相不斷向前流動(dòng)，被分離物質(zhì)間出現(xiàn)向前移動(dòng)的速率差異，由開(kāi)始的單一區(qū)帶逐漸分離出許多區(qū)帶，這個(gè)過(guò)程叫展層。,分類(lèi),按層析的機(jī)理劃分： 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等?！　∥綄游觯豪梦絼┍砻鎸?duì)

3、不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。　　分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離?！　‰x子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。　　凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。,按流動(dòng)相與固定相的不同劃分： 氣相色譜（層析）、液相色譜（層析）。 這兩大類(lèi)層析是以流動(dòng)相不同來(lái)劃分的。 如同時(shí)區(qū)分流動(dòng)

4、相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。,按操作形式劃分： 　　 柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。 紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。 薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類(lèi)似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定?！　?以上劃分無(wú)嚴(yán)格界限，有些名稱(chēng)相互交

5、叉，如親和層析應(yīng)屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。,吸附色譜主要是以氧化鋁、硅膠等為吸附劑，將一些物質(zhì)自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶劑洗脫或展開(kāi)，利用不同化合物受到吸附劑的不同吸附作用，和它們?cè)谌軇┲胁煌娜芙舛龋簿褪抢貌煌衔镌谖絼┥虾腿芤褐g分布情況的不同而得到分離。吸附色譜分離可采用柱色譜和薄層色譜兩種方式。,（一）柱層析法,1.原理,流動(dòng)相流過(guò)時(shí)各組分會(huì)以不同的速率向下移動(dòng)，吸附弱的組

6、分以較快的速率向下移動(dòng)。隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，在新接觸的固定相表面上又依這種吸附-溶解過(guò)程進(jìn)行新的分配，新鮮流動(dòng)相流過(guò)已趨平衡的固定相表面時(shí)也重復(fù)這一過(guò)程，結(jié)果是吸附弱的組分隨著流動(dòng)相移動(dòng)在前面，吸附強(qiáng)的組分移動(dòng)在后面，吸附特別強(qiáng)的組分甚至?xí)浑S流動(dòng)相移動(dòng)，各種化合物在色譜柱中形成帶狀分布，實(shí)現(xiàn)混合物的分離。,2.柱色譜分離條件⑴ 固定相選擇    柱色譜使用的固定相材料又稱(chēng)吸附劑。

7、 吸附劑對(duì)有機(jī)物的吸附作用有多種形式。以氧化鋁作為固定相時(shí)，非極性或弱極性有機(jī)物只有范德華力與固定相作用，吸附較弱；極性有機(jī)物同固定相之間可能有偶極力或氫鍵作用，有時(shí)還有成鹽作用。這些作用的強(qiáng)度依次為： 　　成鹽作用 > 配位作用 > 氫鍵作用 > 偶極作用 > 范德華力作用。 有機(jī)物的極性越強(qiáng)，在氧化鋁上的吸附越強(qiáng)。,表1：各種吸附劑對(duì)于極性有機(jī)物的吸附作用強(qiáng)度,常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、活性炭等（

8、表1）。,纖維素、淀粉硅酸鎂硫酸鈣硅膠弗羅里硅土氧化鎂中性氧化鋁活性炭,,對(duì)極性有機(jī)物的吸附作用增強(qiáng),色譜用的氧化鋁可分酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁pH約為4-4.5，用于分離羧酸、氨基酸等酸性物質(zhì)；中性氧化鋁pH值為7.5，用于分離中性物質(zhì)，應(yīng)用最廣；堿性氧化鋁pH為9-10，用于分離生物堿、胺和其它堿性化合物等。吸附劑的活性與其含水量有關(guān)。含水量越低，活性越高。脫水的中性氧化鋁稱(chēng)為活性氧化鋁。硅膠是中性的吸附劑

9、，可用于分離各種有機(jī)物，是應(yīng)用最為廣泛的固定相材料之一?；钚蕴砍Ｓ糜诜蛛x極性較弱或非極性有機(jī)物。吸附劑的粒度越小，比表面越大，分離效果越明顯，但流動(dòng)相流過(guò)越慢，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生分離帶的再重疊，適得其反。,⑵ 流動(dòng)相選擇    色譜分離使用的流動(dòng)相又稱(chēng)展開(kāi)劑 。     展開(kāi)劑對(duì)于選定了固定相的色譜分離有重要的影響。,在色譜分離過(guò)程中混合物中各組分在吸附劑和

10、展開(kāi)劑之間發(fā)生吸附-溶解分配，強(qiáng)極性展開(kāi)劑對(duì)極性大的有機(jī)物溶解的多，弱極性或非極性展開(kāi)劑對(duì)極性小的有機(jī)物溶解的多，隨展開(kāi)劑的流過(guò)不同極性的有機(jī)物以不同的次序形成分離帶。在氧化鋁柱中，選擇適當(dāng)極性的展開(kāi)劑能使各種有機(jī)物按先弱后強(qiáng)的極性順序形成分離帶，流出色譜柱。,表2：各種展開(kāi)劑對(duì)極性有機(jī)物的溶解能力,石油醚環(huán)己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮吡啶乙醇甲醇水乙酸,,對(duì)極性有機(jī)物的溶解作用增強(qiáng),當(dāng)一種溶劑不能實(shí)現(xiàn)很

11、好的分離時(shí)，選擇使用不同極性的溶劑分級(jí)洗脫。 如一種溶劑作為展開(kāi)劑只洗脫了混合物中一種化合物，對(duì)其它組分不能展開(kāi)洗脫，需換一種極性更大的溶劑進(jìn)行第二次洗脫。這樣分次用不同的展開(kāi)劑可以將各組分分離。,薄層層析又叫薄板色譜，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固-液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，又可用來(lái)精制樣品，

12、此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來(lái)跟蹤有機(jī)反應(yīng)及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”。,（二）薄層層析法,1.原理： 吸附劑被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂層。干燥后在涂層的一端點(diǎn)樣，放入一個(gè)盛有少量展開(kāi)劑的的有蓋容器中。展開(kāi)劑接觸到吸附劑涂層，借毛細(xì)作用向上移動(dòng)。經(jīng)過(guò)在吸附劑和展開(kāi)劑之間的多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)混合物的分離。

13、,2.色譜條件,⑴固定相選擇     柱色譜中提到的吸附劑都可以用作為薄層色譜的固定相，分離性能及使用選擇同柱色譜的選擇原則相同（各種吸附劑見(jiàn)柱色譜表1）。    一般用于薄層色譜時(shí)，要求吸附劑的粒度更小。商品吸附劑區(qū)分為色譜級(jí)（用于柱色譜）和薄層色譜級(jí)（用于薄層色譜）。,⑵展開(kāi)劑選擇    薄層色譜展開(kāi)劑的選

14、擇和柱色譜一樣，主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對(duì)于樣品中各組分溶解度等因素來(lái)考慮。展開(kāi)劑的極性越大，對(duì)化合物的洗脫力也越大。（各種溶劑極性見(jiàn)柱色譜表2）。,選擇展開(kāi)劑時(shí)，除參照表列溶劑極性來(lái)選擇外，更多地采用試驗(yàn)的方法，在一塊薄層板上進(jìn)行試驗(yàn)： ①若所選展開(kāi)劑使混合物中所有的組分點(diǎn)都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過(guò)強(qiáng)； ②若所選展開(kāi)劑幾乎不能使混合物中的組分點(diǎn)移動(dòng)，留在了原點(diǎn)上，此溶劑的極性過(guò)弱。  

15、  當(dāng)一種溶劑不能很好地展開(kāi)各組分時(shí)，常選擇用混合溶劑作為展開(kāi)劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)溶劑展開(kāi)混合物，若展開(kāi)不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗(yàn)，直到選出合適的展開(kāi)劑組合。合適的混合展開(kāi)劑常需多次仔細(xì)選擇才能確定。,⑶相對(duì)移動(dòng)值 從點(diǎn)樣原點(diǎn)開(kāi)始到展開(kāi)后的溶劑前沿，是溶劑的移動(dòng)距離，記為l0，混合物中各組分的移動(dòng)距離分別記為l1，l2，l3 …（移動(dòng)值示意圖）。,比移值示意圖,在不同的展開(kāi)條

16、件下，各化合物的移動(dòng)距離不會(huì)相同，而在同一條件下，相對(duì)于展開(kāi)劑的移動(dòng)距離，各化合物有可比較的展開(kāi)數(shù)據(jù)，稱(chēng)為相對(duì)移動(dòng)值，或比移值： Rf=l1/l0在相同條件下測(cè)得的比移值可以作為化合物的薄層色譜特征值進(jìn)行比較對(duì)照。,l0,l1,l2,⑷顯色     分離的化合物若有顏色，很容易識(shí)別出來(lái)各個(gè)樣點(diǎn)。但多數(shù)情況下化合物沒(méi)有顏色，要識(shí)別樣點(diǎn)，必須使樣點(diǎn)顯色。通用的顯色方法有碘蒸氣顯色和紫外線(xiàn)顯色。&

17、#160;   ①碘蒸氣顯色：將展開(kāi)的薄層板揮發(fā)干展開(kāi)劑后，放在盛有碘晶體的封閉容器中，升華產(chǎn)生的碘蒸氣能與有機(jī)物分子形成有色的締合物，完成顯色。    ②紫外線(xiàn)顯色：用摻有熒光劑的固定相材料（如硅膠F，氧化鋁F等）制板，展開(kāi)后在用紫外線(xiàn)照射展開(kāi)的干燥薄層板，板上的有機(jī)物會(huì)吸收紫外線(xiàn)，在板上出現(xiàn)相應(yīng)的色點(diǎn)，可以被觀察到。   

18、0;有時(shí)對(duì)于特殊有機(jī)物使用專(zhuān)用的顯色劑顯色。此時(shí)常用盛有顯色劑溶液的噴霧器噴板顯色。,3.薄層色譜應(yīng)用,⑴可用于判斷兩個(gè)化合物是否相同（同一展開(kāi)條件下是否有相同的移動(dòng)值）； ⑵可用于確定混合物中含有的組分?jǐn)?shù)；⑶可用于為柱色譜選擇合適的展開(kāi)劑，監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果；⑷可用于檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程。,三、基本操作,正確裝柱、制板、點(diǎn)樣及分離操作,,,薄層板在不同的層析缸中展開(kāi)的方式,1、裝柱用鑷子取少許脫脂棉放于干凈的色譜柱底部

19、，輕輕塞緊，關(guān)閉活塞，通過(guò)一干燥的玻璃漏斗向柱中慢慢加入色譜柱用中性氧化鋁10g，并用橡皮塞輕輕敲打色譜柱下部，使填裝緊密，在上面加一片小圓濾紙或脫脂棉使表面水平。用滴管沿管壁加入酒精，使酒精順柱體向下展開(kāi)，打開(kāi)活塞，控制流出速度為1滴/秒。,【柱色譜操作步驟】,2、進(jìn)樣 待酒精全部浸潤(rùn)氧化鋁，液面剛好流至濾紙面時(shí)，立即用滴管從層析柱管中心加入待分離樣品溶液，當(dāng)此溶液流至接近濾紙面時(shí)，立即用少量溶劑洗下管壁的有色物質(zhì)

20、，如此連續(xù)2—3次，直至洗凈為止。3、洗脫 依次用酒精和NaOH洗脫，控制流出速度。整個(gè)過(guò)程都應(yīng)有洗脫劑覆蓋吸附劑。（每一種試劑加入前，前一種都要?jiǎng)倓偨^(guò)濾紙片）,【薄層色譜操作步驟】,1、薄層板的制備（濕板的制備） 薄層板制備的好壞直接影響色譜的結(jié)果。薄層應(yīng)盡量均勻且厚度要固定。否則，在展開(kāi)時(shí)前沿不齊，色譜結(jié)果也不易重復(fù)。在燒杯中放入2g硅膠，加入5—6ml蒸餾水，調(diào)成糊狀。將配制好的漿料傾注到

21、清潔干燥的載玻片上，拿在手中輕輕的左右搖晃，使其表面均勻平滑，在室溫下晾干后進(jìn)行活化。也可買(mǎi)市售的硅膠板切割成適宜大小備用。本實(shí)驗(yàn)用此法制備薄層板：吸附劑為硅膠G，用0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液調(diào)成漿料。,2、點(diǎn)樣 先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線(xiàn)作為起始線(xiàn)，然后用毛細(xì)管吸取樣品，在起始線(xiàn)上小心點(diǎn)樣，吹干。斑點(diǎn)直徑一般不超過(guò)2mm。若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防

22、樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。若在同一板上點(diǎn)幾個(gè)樣，樣點(diǎn)間距離應(yīng)為0.5-1cm，且不能離邊沿太近。點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。 當(dāng)展開(kāi)劑到達(dá)距離另一端0.5cm處時(shí)拿出薄板，用鉛筆將最遠(yuǎn)處做好記號(hào)，吹干樣品點(diǎn)，測(cè)量l1、l0，計(jì)算Rf,3、展開(kāi) 薄層色譜的展開(kāi)，需要在密閉容器中進(jìn)行。在層析缸中加入配好的展開(kāi)溶劑，使其高度不超過(guò)1cm。將點(diǎn)好的薄層板小心放入層析缸中，點(diǎn)樣一端朝下（點(diǎn)樣面朝上），浸

23、入展開(kāi)劑中。蓋好瓶蓋，觀察展開(kāi)劑前沿上升到一定高度時(shí)取出，盡快在板上標(biāo)上展開(kāi)劑前沿位置。吹干，觀察斑點(diǎn)位置，計(jì)算Rf值。,四、實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵及注意事項(xiàng)：,1、薄層層析時(shí)，薄層板的制備要厚薄均勻，表面平整光潔。2、點(diǎn)樣時(shí)，各樣點(diǎn)間距1—1.5cm，樣點(diǎn)直徑應(yīng)不超過(guò)2mm，不能太靠邊。3、柱層析時(shí)，柱子要致密緊實(shí)，無(wú)氣泡。洗柱、分離時(shí)洗脫劑液面不能低于柱中填充物上面。,吸附劑的吸附力強(qiáng)弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來(lái)決定

24、。被吸附物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。 常用吸附劑的吸附力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋夯钚蕴?、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最強(qiáng)。 吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用于能溶于有機(jī)溶劑的有機(jī)化合物的分離，較少用于無(wú)機(jī)化合物。 洗脫溶劑的解析能力的強(qiáng)弱順序是：醋酸、水、甲醇、

25、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數(shù)種不同強(qiáng)度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統(tǒng)，以獲得最佳分離效果。,,吸附層析,在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等，這些親水物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速度向前移動(dòng)的區(qū)帶。,,分配層析,離子交換層析,支持物是人工交聯(lián)的帶

26、有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分子，如離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。 帶陽(yáng)離子基團(tuán)的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽(yáng)離子交換劑。帶陰離子基團(tuán)的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級(jí)胺乙基）等為陰離子交換劑。 離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機(jī)物和無(wú)機(jī)物。對(duì)于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團(tuán)在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物

27、的離子，各種物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周?chē)芤旱碾x子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù)，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時(shí)，增加溶液的離子強(qiáng)度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來(lái)。洗脫過(guò)程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。,,支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內(nèi)為內(nèi)水層，凝膠周?chē)乃疄橥馑畬印？刂平宦?lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠只允許被分離物質(zhì)中小于孔徑的分子進(jìn)入，大于孔徑的分子被排斥在外水層，最