1、生物的遺傳變異是生物學(xué)研究的核心主題，而遺傳標(biāo)記則是揭示生物遺傳變異信息和規(guī)律的重要工具之一。遺傳標(biāo)記的發(fā)展體現(xiàn)著生命科學(xué)的發(fā)展，這種發(fā)展不僅是技術(shù)水平的進(jìn)步和理論成果的獲取，更是對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)不斷深化、系統(tǒng)化的反映。DNA條形碼技術(shù)是新一代的DNA遺傳標(biāo)記，它提供了一種快速且廉價(jià)的物種鑒定方法，即使是非物種分類學(xué)家也可以使用這個(gè)工具獲取生物系統(tǒng)學(xué)信息。DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展為新分子標(biāo)記的開發(fā)提供了重要的思路：選擇核基因區(qū)域，從而避免

2、單性遺傳的線粒體基因在系統(tǒng)發(fā)生分析時(shí)的偏向性；最好是具有保守結(jié)構(gòu)域的、含有多個(gè)成員的基因家族，實(shí)現(xiàn)多基因的交叉驗(yàn)證；所選擇的目的基因結(jié)構(gòu)區(qū)域應(yīng)當(dāng)具有高度保守性，從處于不同的系統(tǒng)發(fā)生譜系的各種不同的動(dòng)物類群中都能得到擴(kuò)增。
　　 SOX基因家族成員具有一個(gè)編碼80個(gè)氨基酸殘基的高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域，是一類可以與DNA特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。Sox-HMG分子標(biāo)記方法通過針對(duì)Sox基因HMG域保守序列設(shè)計(jì)特殊簡(jiǎn)并引物，可以從各種不同動(dòng)

3、物的基因組中擴(kuò)增獲得具有特定數(shù)目和長(zhǎng)度的DNA片段，這些片段構(gòu)成物種特異的Sox-HMGDNA條帶模式；并進(jìn)一步通過克隆測(cè)序，獲得這些DNA片段特異的DNA序列，從而獲得多水平、交叉驗(yàn)證的物種特異Sox-HMG分子標(biāo)記。本研究將具有高度保守結(jié)構(gòu)的基因家族成員作為研究對(duì)象，創(chuàng)新性地開展了分子標(biāo)記研究，為Sox基因研究和分子標(biāo)記研究提供了可供借鑒的新的思路。通過揭示Sox-HMG分子標(biāo)記方法的基本原理和作用機(jī)制，探討這一全新分子標(biāo)記方法的適

4、用性和實(shí)用性。拓展Sox-HMG分子標(biāo)記方法應(yīng)用領(lǐng)域。本文的主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.采集屬于不同分類類群的動(dòng)物物種基因組DNA樣本；利用針對(duì)Sox基因HMG結(jié)構(gòu)域保守序列設(shè)計(jì)的特殊簡(jiǎn)并引物，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA樣本；利用瓊脂糖凝膠技術(shù)，分離PCR產(chǎn)物，獲得各動(dòng)物物種的Sox-HMGDNA條帶模式；利用PCR產(chǎn)物純化和克隆技術(shù)，獲得Sox-HMGDNA序列。
　　 2.對(duì)獲得的Sox-HMGDNA序列開展比

5、較分析，結(jié)合SSCP技術(shù)對(duì)Sox-HMGDNA片段進(jìn)行進(jìn)一步分離，研究產(chǎn)生Sox-HMGDNA條帶模式多樣性的原因，闡述Sox-HMG分子標(biāo)記方法作用機(jī)制；在揭示Sox-HMG分子標(biāo)記方法基本原理和作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，與現(xiàn)有的其他DNA分子標(biāo)記方法比較分析，主要是與DNA條形碼技術(shù)比較，對(duì)比討論Sox-HMG分子標(biāo)記在生物系統(tǒng)學(xué)研究、遺傳育種研究和實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)。
　　 3.利用Sox-HMG分子標(biāo)記方法獲得的Sox基因HMG結(jié)

6、構(gòu)域編碼序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，開展系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究；利用Sox-HMG分子標(biāo)記方法，在多種動(dòng)物物種中獲得Sox9基因HMG域DNA序列，對(duì)擴(kuò)增獲得的Sox9基因HMG域序列開展結(jié)構(gòu)分析；對(duì)擴(kuò)增獲得的鯉科魚類Sox9基因HMG域內(nèi)含子開展系統(tǒng)進(jìn)化討論。
　　 4.使用Sox-HMG分子標(biāo)記方法在異源四倍體鯽鯉中獲得Sox4基因5’端調(diào)控區(qū)序列；利用PCR擴(kuò)增、限制性酶切等方法，構(gòu)建Sox4啟動(dòng)子重組質(zhì)粒；以綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因，

7、通過顯微注射方法，研究Sox4基因在異源四倍體胚胎中的轉(zhuǎn)錄情況，探討Sox4基因功能。
　　 研究結(jié)果證明，Sox-HMG分子標(biāo)記是一種全新的、基于Sox基因HMG結(jié)構(gòu)域保守序列的DNA分子標(biāo)記。通過揭示Sox-HMG分子標(biāo)記方法的基本原理和作用機(jī)制，證明了這一全新的方法在各分類類群的不同動(dòng)物物種系統(tǒng)生物學(xué)研究中具有廣泛適用性。并且這一方法特別適用于在遠(yuǎn)緣雜交遺傳育種工程研究中，區(qū)別和鑒別具有復(fù)雜遺傳背景的不同品系。本研究將具有

8、高度保守結(jié)構(gòu)的基因家族成員作為研究對(duì)象，創(chuàng)新性地開展了分子標(biāo)記研究，為Sox基因研究和分子標(biāo)記研究提供了可供借鑒的新的思路。利用所獲得的Sox-HMG相關(guān)序列，開展了系統(tǒng)進(jìn)化分析和內(nèi)含子進(jìn)化研究，證明了這一全新的分子標(biāo)記方法為系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了豐富的遺傳信息。構(gòu)建了Sox4-EGFP重組質(zhì)粒，通過顯微注射方法，研究Sox4基因在異源四倍體胚胎中的轉(zhuǎn)錄情況，探討了異源四倍體鯽鯉Sox4基因功能。同時(shí)，進(jìn)一步證明了Sox-HMG分子標(biāo)記在基