1、角質(zhì)酶是一種具有水解酯鍵能力的酶，屬于α/β水解酶家族中的一種?？梢源呋飧鞣N長短鏈的甘油三酯等酯類。由于反應條件溫和、催化效率高等特點，近些年來在紡織、食品等行業(yè)中應用非常廣泛。桃褐腐菌(Monilinia fructicola)是一種可致桃樹果實腐爛的真菌，對果實生產(chǎn)造成嚴重經(jīng)濟損失。其侵染桃果實的主要過程就是誘導自身表達角質(zhì)酶，分解桃果實表皮中的角質(zhì)類物質(zhì)?，F(xiàn)階段對于基因工程生產(chǎn)角質(zhì)酶的研究集中在腐皮鐮胞菌(Fusarium s

2、olani)角質(zhì)酶基因和嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)等菌種中，通過獲取這兩類菌體中的角質(zhì)酶基因進行基因工程菌的構(gòu)建。然而文獻中對于桃褐腐菌角質(zhì)酶基因的應用并不深入。原核基因工程表達系統(tǒng)具有發(fā)酵時間短、高效、構(gòu)建過程簡單等優(yōu)點。本實驗采用大腸桿菌(E.coli)BL21及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)兩種表達系統(tǒng)，分別使用pET-28a質(zhì)粒及pET-PK質(zhì)粒。在大腸桿菌的甘油代謝途徑中，

3、pET-28a可由IPTG誘導T7啟動子大量胞內(nèi)表達重組載體中的基因片段。在肺炎克雷伯菌的甘油代謝途徑中，由于克雷伯菌自身的組成型啟動子是PK啟動子，在甘油存在的條件下即可表達。pET-PK質(zhì)粒由pET-28a質(zhì)粒改造而得，將原有的T7啟動子換成PK啟動子后，下游連接重組片段參與工程菌的組成型胞內(nèi)表達。
　　 本實驗通過獲取桃褐腐菌角質(zhì)酶基因cut1，分別連接至pET-28a與pET-PK質(zhì)粒中。重組大腸桿菌pET-28 A-c

4、ut1/BL21由化學法轉(zhuǎn)化而得，重組克雷伯菌pET-PK-cut1/k.p由電轉(zhuǎn)化方法而得。通過對兩株重組菌表達條件分析、表達生物量測定、表達單位蛋白量測定、表達單位酶活量測定等步驟，可確定重組大腸桿菌在誘導表達18小時后產(chǎn)生角質(zhì)酶的酶活可達每100μL4 U，重組克雷伯菌在表達21小時后酶活可達每100μL5U，然而重組克雷伯菌的單位蛋白量并沒有顯著提高，說明表達量尚有可上升的空間。此外，本實驗成功構(gòu)建了重組畢赤酵母pPICZαA-