1、漆酶(EC1.1.0.32，對苯二酚：氧氧化還原酶)是一種含多個銅原子的多酚氧化酶，具有較高的氧化還原電位，能催化氧化多種芳香類化合物，在環(huán)境保護、制漿造紙、食品加工、有機合成等領域具有廣闊的應用前景。本研究以漆酶的高效生產(chǎn)為目標，對漆酶高效產(chǎn)生菌株Trametes hirsuta BYBF進行了擴大培養(yǎng)、漆酶的分離純化及酶學性質、漆酶在氯酚類廢水中的應用等方面進行了較為系統(tǒng)的研究和分析，并對此漆酶基因的克隆進行了初探。
　　

2、氣升式生物反應器的結構簡單、反應啟動快、氧傳質效率高、剪切力小，利用菌絲球在流化床內(nèi)產(chǎn)漆酶，可以使菌絲球、發(fā)酵液和氧氣得到充分接觸，能大大加快白腐菌產(chǎn)漆酶的進程。本實驗室擬采用自己設計的2.5L三相流化床生物反應器進行產(chǎn)酶研究，實驗結果表明：在通氣量是3.0L/min，接種量是10％的條件下，發(fā)酵五天后酶活即可達到3.36IU/mL，與搖瓶發(fā)酵相比（1.58IU/mL），不僅縮短了產(chǎn)酶周期，而且酶活也得到了大幅度的提高，大大提高了產(chǎn)酶效

3、率和產(chǎn)酶量。利用流化床生物反應器還可對菌絲球進行重復分批發(fā)酵，實驗表明Trametes hirsuta BYBF菌絲球至少可以重復發(fā)酵五次，漆酶產(chǎn)率均在0.5 IU/(mL·d)以上。該工藝不僅節(jié)省了液體菌種的培養(yǎng)時間和消耗，而且減少了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，為漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。
　　 通過離心、過濾收集白腐菌Trametes hirsuta BYBF的發(fā)酵液即得粗酶液，然后通過硫酸銨沉淀、透析濃縮、DEAE-Sep

4、harose 陰離子層析柱和SephadeXG-100分子篩層析對所得粗漆酶進行了分離純化，得率是8.9％，純化倍數(shù)是10.2，純化后得到的漆酶經(jīng)SDS-PAGE檢測證實為單一蛋白，并與標準蛋白比較得到此漆酶的表觀分子量為33.9KDa。以ABTS為底物時，酶的最適反應溫度和pH分別是55℃和4.5。此酶具有較好的溫度和pH穩(wěn)定性，基本能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)對酶的要求。
　　 此外，還以愈創(chuàng)木酚和ABTS為底物對漆酶的反應動力性進行了

5、研究，以愈創(chuàng)木酚為底物時，Km和Vmax分別是1.32 mmol/L和4.5×10-6 mol/L﹒min，以ABTS為底物時，Km和Vmax分別是0.032mmol/L和8.7×10-6 mol/L﹒min，所以漆酶對ABTS具有較大的反應活性。在最佳的反應條件下，我們研究了濃度為2mmol/L無機元素對酶活性的影響：Fe3+、Ag+、Mn2+對酶活性具有抑制作用，Mg2+、Cl-、Na+、Ca2+對酶活影響不大，而Cu2+、Al3+

6、、Zn2+能明顯提高漆酶的活性，其中Cu2+對提高漆酶活性提高幅度最大。
　　 制漿造紙工業(yè)中氯漂廢水中含有大量的氯代酚及其衍生物，這類有毒物質排放到環(huán)境中嚴重威脅著生態(tài)平衡。本研究以2,4-二氯苯酚（簡稱2,4-DCP）為氯酚類化合物的模型物，在曝氣的條件下，研究白腐菌Trametes hirsuta BYBF產(chǎn)漆酶對2,4-DCP的去除效果：研究發(fā)現(xiàn)2,4-DCP的去除率隨反應時間的延長而增大，在適宜的條件下，當?shù)孜餄舛葹?

7、0mM/L時，曝氣20h后去除率就可以達到93.6％。此外,2,4-DCP的去除效果也受到反應體系的溫度、pH值等因素的影響，在溫度和pH是25℃-45℃和pH4-6范圍內(nèi)是具有較好的去除效果。在最適條件下曝氣20h，純化漆酶和粗漆酶液對2,4-DCP的去除率分別為84.9％和93.6％，這就說明純化漆酶要比粗酶液處理酚類物質的效果要差一些。
　　 最佳條件下，在漆酶的作用下曝氣10h，經(jīng)蛋白酶和水洗處理后，測得聚合物的分子量為

8、2838（二氯代酚的分子量為163），可見漆酶對2,4-DCP有很好的催化聚合作用。用紅外和13C-NMR對處理后的聚合產(chǎn)物的結構進行了分析，產(chǎn)物是帶有酚羥基的高分子聚合產(chǎn)物，并且聚合產(chǎn)物上的苯環(huán)在漆酶的作用下會發(fā)生開環(huán)反應產(chǎn)生帶羧基的脂肪族側鏈。推測其催化聚合反應機理可能是首先生成酚氧游離基，游離基之間相互結合生成二聚體或三聚體，然后發(fā)生電子轉移，進一步脫氯生成相對穩(wěn)定的低分子聚合物，低分子聚合物之間也能發(fā)生脫氯聚合生成高聚物，最后高

9、分子聚合物中部分苯環(huán)會發(fā)生開環(huán)反應，生成羧酸類物質。此外，底物之間還能發(fā)生交叉偶聯(lián)，生成復雜的交聯(lián)產(chǎn)物，這樣就可以使有毒的酚生成疏水性高聚物通過沉淀而除去。
　　 此外，還成功地用CTAB法提取了此白腐菌的DNA，提取RNA并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖譜表明分離得到了高純度的DNA和RNA，滿足了分子生物學對基因片段的要求，根據(jù)實驗要求，設計并合成了漆酶基因的簡并引物，通過RT-PCR的方法成功擴增了漆酶的基因，并分析確定克隆